miRNA骨架內(nèi)置siRNA干擾J亞群禽白血病病毒復(fù)制.pdf

1、J亞群禽白血病(subgroup J of avian leukosis virus)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的J亞群禽白血病病毒引起的以髓細(xì)胞瘤和其他細(xì)胞惡性腫瘤為特征的傳染性腫瘤性疾病。J亞群禽白血病病毒（ALV-J）的基因排列順序從5'端至3'端依次為LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR，主要含有g(shù)ag、pol、env三個結(jié)構(gòu)基因及結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的長末端序列(long terminal repeats，LTR)

2、。
　　近年來，雖然各檢測技術(shù)有所提高，但因一些條件限制，該病對我國的危害依然很大。由于亞群間各毒株比較相近，但不同遺傳特征的病毒引起的不同腫瘤的潛伏期不同，所以目前尚無有效防治J亞群禽白血病的方法;由于ALV-J的垂直傳播性、先天感染的免疫耐受雞是主要的傳染源，目前也無可用的疫苗，所以應(yīng)該另尋方法，靶向于病毒找尋攻克這一難題的方法。
　　RNA干擾(RNA interfrence，RNAi)，是由21 nt～23 nt的雙

3、鏈RNA(Double strandedRNA，dsRNA)引起的同源的內(nèi)源性mRNA降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，所以為了更好的減輕ALV-J帶給養(yǎng)禽業(yè)的損失，探索利用RNAi技術(shù)去解決這一難題。
　　通過比較ALV-J不同毒株的同源性，針對ALV-J NX0101毒株的gag基因中p15編碼區(qū)、pol基因中p32編碼區(qū)、env中g(shù)p85編碼區(qū)及LTR基因中的U3編碼區(qū)中同源性較高的區(qū)域篩選到4對siRNA，設(shè)計將siRNA

4、置于miRNA骨架結(jié)構(gòu)中，人工合成，將其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體中，構(gòu)建了miRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為:p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR和p-miR-mock（陰性對照），進(jìn)行單獨(dú)干擾和聯(lián)合干擾，將其轉(zhuǎn)染105.2 TCID50 ALV-J(NX0101)感染的DF-1細(xì)胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分別

5、在蛋白水平和核酸水平上檢測表達(dá)質(zhì)粒抑制ALV-J復(fù)制效果。將質(zhì)粒與病毒腹腔接種1日齡SPF雛雞，隔日采棉拭子，檢測ALV-J p27，對其排毒情況進(jìn)行監(jiān)測，每6天采血，分離血清，對其進(jìn)行抗體檢測，分別在2周齡和4周齡時剖殺5只/組，通過血液學(xué)檢測、大體病變和組織學(xué)病變方面評估m(xù)iRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)的抗病毒效果，進(jìn)而分析其在臨床上的使用價值。
　　細(xì)胞中抗病毒實驗結(jié)果表明:(1)4個表達(dá)質(zhì)粒能使靶基因的mRNA和囊膜蛋白的表達(dá)

6、水平顯著降低，與陰性對照和空載體對照相比，p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR重組表達(dá)干擾質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞中對ALV-J核酸抑制率分別為:83％、78％、85％、74％;(2) p-miR-LTR與其他三種p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env干擾質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染接毒細(xì)胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分別檢測其對ALV-J在DF-1細(xì)胞中

7、復(fù)制的影響。聯(lián)合干擾后，p-miR-gag+LTR、p-miR-pol+LTR、p-miR-env+LTR對ALV-J的抑制更有效，核酸抑制率分別為:98％、98％和96％，由此顯示，聯(lián)合干擾對病毒的抑制具有協(xié)同作用，可以更顯著的抑制病毒的增殖。體內(nèi)抗病毒結(jié)果:(1)對各組雞棉拭子ALV-J p27檢測顯示，與ALV-J接毒組和空載體mock組相對比，所有重組質(zhì)粒干擾組感染初期(1-10d)有效的抑制了病毒的增殖，其S/P值基本都在臨界

8、值之下，后期各重組質(zhì)粒干擾組排毒有升高趨勢，但均低于陽性對照組，單獨(dú)與聯(lián)合干擾組干擾效果差異不顯著;(2)血液學(xué)檢測顯示，干擾組的白細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞數(shù)均接近正常值;(3)病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，ALV-J接毒組的腎臟、肝臟等器官有淋巴細(xì)胞增生灶，腦、肺臟出血，法氏囊萎縮，而重組表達(dá)干擾質(zhì)粒組只有部分器官呈現(xiàn)少許的炎性細(xì)胞的浸潤，聯(lián)合干擾組大體剖檢及病理學(xué)檢測無明顯病變。
　　由此看出本實驗所篩選到的4對siRNA在體外細(xì)胞和動物體內(nèi)都