J亞群禽白血病病毒與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒Exosome途徑協(xié)同感染機制.pdf

1、近年來，J亞群禽白血病病毒（ALV-J）和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）共同感染和協(xié)同致病的現(xiàn)象廣泛發(fā)生，給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失，然而，關(guān)于ALV-J和REV協(xié)同感染的機制尚不明了。Exosome是由細(xì)胞分泌的一種功能性小囊泡，它通過調(diào)節(jié)特異性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的分泌，參與體內(nèi)多種的生理和病理過程。Exosome為我們研究ALV-J與REV協(xié)同感染機制提供了新思路。
　　本研究在證明ALV-J和REV具有協(xié)同感染能力的

2、基礎(chǔ)上，擬通過分析共感染ALV-J+REV細(xì)胞分泌的exosome的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)(miRNA)，揭示ALV-J和REV共同利用的細(xì)胞通路，從而初步闡明ALV-J與REV協(xié)同感染機制，為聯(lián)合防控及其它病毒間協(xié)同感染機制研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　將ALV-J-NX0101病毒和REV-SNV株病毒接種無特定病原體（SPF）雞胚分離的雞胚成纖維細(xì)胞，設(shè)置4個實驗組：ALV-J+REV組，ALV-J組，REV組，和無病毒空白對照組。

3、經(jīng)PCR、間接免疫熒光（IFA）和禽白血病抗原（p27）檢測接毒成功后，以熒光定量PCR方法從病毒轉(zhuǎn)錄層面證明ALV-J和REV協(xié)同感染，結(jié)果顯示在感染72h內(nèi)，共同感染組中ALV-J和REV的RNA轉(zhuǎn)錄水平均高于單獨感染組；通過激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察發(fā)現(xiàn)，ALV-J和REV共同感染組REV蛋白表達較單獨感染組提前24h，ALV-J的蛋白表達較單獨感染組增強，從蛋白層面證明了ALV-J和REV具有協(xié)同感染作用。
　　

4、為研究ALV-J和REV共感染細(xì)胞分泌的exosome在免疫抑制上是否也具有協(xié)同作用，我們無菌分離42日齡SPF雞脾白細(xì)胞，加入定量的Exosomes共同培養(yǎng)一定時間，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量，ELISA實驗檢測IL-2、IL-10、IL-12的分泌情況。結(jié)果顯示，12h之前，Exo-RJ組CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量均低于對照組；IL-2的分泌量在4h，Exo-RJ組高于對照組，且與Exo-R組差異顯著；IL-

5、10的分泌量在8h，Exo-RJ均顯著低于對照組；IL-12的分泌量在0.5h，Exo-RJ均低于對照組，且差異顯著。這說明共感染ALV-J和REV細(xì)胞分泌的exosomes對免疫細(xì)胞抑制作用增強。
　　為揭示ALV-J和REV是否共同利用細(xì)胞信號通路達到協(xié)同作用，我們對提取到的exosome進行iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同時用相同的exosome樣品提取RNA進行Hiseq miRNA分析。結(jié)果顯示，在CEF細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取的

6、exosome中共鑒定了1154種蛋白質(zhì)，932種已知miRNA和785種未知miRNA。四組exosomes中均存在exosome的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，如Hsp70、Hsp90、四跨膜蛋白、14-3-3等，而且我們exosome中檢測到了ALV-J的gag、env蛋白質(zhì)以及REV的gag、pol和env蛋白質(zhì)，這說明病毒感染細(xì)胞分泌的exosome中攜帶了病毒結(jié)構(gòu)蛋白。通過對表達差異蛋白的靶標(biāo)蛋白、差異miRNA靶標(biāo)蛋白的聚類及信號通路分析

7、，發(fā)現(xiàn)差異蛋白NCKAP1與差異miRNA靶蛋白ITGA1位于共同的肌動蛋白細(xì)胞骨架（Regulation of actin cytoskeleton）信號通路上，使ARP2/3蛋白下調(diào)，抑制肌動蛋白聚合及板狀偽足形成，說明ALV-J和REV從蛋白質(zhì)水平和miRNA水平共同啟動了肌動蛋白細(xì)胞骨架通路，從而形成協(xié)同作用。肌動蛋白細(xì)胞骨架，是纖維狀肌動蛋白在細(xì)胞中的分布網(wǎng)絡(luò)，它具有維持細(xì)胞形狀、調(diào)控細(xì)胞粘連及細(xì)胞運動等功能。實驗證明該通路的