禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒env基因蛋白抗原的表達(dá)及其檢測(cè)應(yīng)用.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的一種禽類重要的腫瘤性疾病，目前在我國(guó)的流行和危害越來(lái)越嚴(yán)重。該病直接導(dǎo)致禽死亡雖然并不常見(jiàn)，但感染禽表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、免疫抑制，降低疫苗接種的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致免疫失敗和降低雞體對(duì)疾病的抵抗力，導(dǎo)致禽群的淘汰率和死亡率升高，進(jìn)而給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了建立ELISA等快速、特異、簡(jiǎn)便的診斷技術(shù)，表達(dá)REV的囊膜糖蛋白env基因作為抗原并研制其相應(yīng)的抗體是十分必要的，對(duì)

2、該病的防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 根據(jù)已發(fā)表的REV毒株鴨脾壞死病(SNV)的序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，以SNV前病毒cDNA全基因組克隆為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出該病毒的囊膜糖蛋白env基因的整個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)；將PCR產(chǎn)物按正確的閱讀框架定向克隆進(jìn)pGEX-6P-1載體中谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的下游，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中，在1.0 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下，env基因以融合蛋白的形式獲得了良

3、好的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，證實(shí)其表達(dá)的融合蛋白的大小為72kD；Western-Blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，純化的pGEX-6P-1-env重組融合蛋白抗原與REV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)性。 將表達(dá)產(chǎn)物回收后免疫小鼠，所得的抗血清可與SNV感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在免疫熒光試驗(yàn)(FA)呈陽(yáng)性反應(yīng)。這表明，體外表達(dá)的重組融合蛋白具有很好的免疫原性，而且保留了天然蛋白所具有的抗原性。 以純化