禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒三種檢測方法的建立.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生?。≧eticuLoendotheliosis，RE）是由禽網(wǎng)內(nèi)狀皮組織增生病病毒（ReticuLoendotheliosis Virus，REV）引起禽類發(fā)生的以淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞增生為特征的腫瘤性病理綜合征。REV在我國家禽中的感染率已達(dá)30％左右，REV感染不僅能引起腫瘤，還可以引起胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮，導(dǎo)致免疫功能下降、甚至免疫抑制，并且極易繼發(fā)感染其他病毒病和細(xì)菌病。REV一旦污染生物制品后，可以導(dǎo)致REV大

2、面積人工傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因?yàn)镽EV感染雞群無明顯癥狀和病變，因此REV的檢測顯得尤為重要。
　　 本文首先以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒的cDNA建立了PCR檢測方法。是以全病毒感染為基礎(chǔ)所建立的檢測方法。在REV的3個基因上設(shè)計(jì)了3種特異引物，能特異性的檢測REV樣品，最低檢測限度為104拷貝/uL。PCR檢測方法不與其他禽病病原發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。
　　 其次以REV的LTR和gag基因的保

3、守區(qū)域各設(shè)計(jì)并合成一對引物，建立SYBR GreenⅠ實(shí)時熒光PCR檢測方法(Real-time PCR)。以pMD-18T-LTR(p-LTR)，pMD-18T-gag(p-gag)重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系良好;敏感性能檢測到10拷貝標(biāo)準(zhǔn)品;能特異性檢測REV樣品，不與其它禽相關(guān)病原發(fā)生交叉反應(yīng);板內(nèi)、板間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均低于3％。應(yīng)用該方法對人工感染REV

4、的雞的心，肝，脾，肺，腎，盲腸扁桃體，腺胃和法氏囊進(jìn)行初步檢測，結(jié)果顯示法式囊中的含量最高。本研究建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時熒光PCR方法為REV的快速檢測、分子流行病學(xué)調(diào)查以及監(jiān)測REV污染疫苗情況提供新方法。
　　 用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒gp90全長蛋白建立了ELISA方法，確定的包被抗原濃度為1μg/mL，被檢血清的稀釋度為1∶400。用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒gp90全長蛋白所建立ELISA方法特異性良好;得到

5、間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn):S/P值≥0.428者判定為陽性，S/P≤0.349者判定為陰性，介于兩者之間判定為可疑。板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于7％，說明此檢測方法重復(fù)性較好。與同類商品化試劑盒的對比的符合率為93.5％。表明本檢測方法可靠，可用于REV感染的血清學(xué)調(diào)查。
　　 PCR檢測方法可以作為REV流行病學(xué)調(diào)查的一種方法，應(yīng)用范圍廣，可進(jìn)行大批量檢測。SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法克服了常規(guī)PCR因靈敏度不夠而導(dǎo)