三種病毒RPA檢測(cè)方法的建立及陽(yáng)性對(duì)照品的制備.pdf

1、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)，是一種以蜱為傳播媒介的蟲(chóng)媒病毒，隸屬于黃病毒科黃病毒屬，共分為三個(gè)亞型，東歐亞型、西伯利亞亞型、遠(yuǎn)東亞型。蜱傳腦炎病毒的暴露極易導(dǎo)致蜱傳腦炎的發(fā)生，蜱傳腦炎是一種累及中樞系統(tǒng)的病毒感染性疾病。10％-20%的病毒感染患者會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)性或永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，預(yù)后不好。近年來(lái)，我國(guó)北部林區(qū)的病例報(bào)告數(shù)目持續(xù)增加。
　　埃博拉病毒(Ebola virus

2、, EBOV)是引起人類及其他哺乳動(dòng)物致死性埃博拉出血熱的病原體。埃博拉病毒隸屬于絲狀病毒科，埃博拉病毒屬，分為五個(gè)亞型，分別為：扎伊爾型，蘇丹型，科特迪瓦型，雷斯頓型和本地布焦型。其中扎伊爾型及蘇丹型對(duì)人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的致病性和致死率很高。同時(shí)，引起此次2013-2015西非埃博拉出血熱大暴發(fā)的也正是扎伊爾型埃博拉出血熱，最終導(dǎo)致至少28638名疑似病例，11315病例確認(rèn)死亡。因目前尚無(wú)特效的疫苗及治療藥物，世界衛(wèi)生組織將其列為

3、生物安全4級(jí)病原微生物。
　　中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)，也被稱為駱駝流感，是由中東呼吸綜合征冠狀病毒引起的病毒性感染性呼吸道綜合征。發(fā)病癥狀嚴(yán)重程度從中度到重度不等，主要臨床癥狀有發(fā)熱，咳嗽，腹瀉，氣短等。疾病在免疫力低下及患有其他疾病的病人身上更為嚴(yán)重。目前，沒(méi)有針對(duì)于此疾病的特效疫苗和治療藥物。截止2015年5月，已報(bào)道1000

4、名病例，他們中的40%已經(jīng)死亡。中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，是β冠狀病毒屬的新成員，2012年第一次被報(bào)道，而就在2015年6月，全世界21個(gè)城市都出現(xiàn)了報(bào)告病例，其中包括英國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)和我國(guó)的澳門，在一定程度上引起了大家的關(guān)注和恐慌。
　　因此，病毒感染性疾病的早期診斷與及時(shí)治療對(duì)患者的康復(fù)及預(yù)后都起著至關(guān)重要的作用。而病毒的檢測(cè)則是疾病確切診斷的前提條件。目前，病毒感染的實(shí)驗(yàn)室及臨床診斷檢測(cè)方法主要有病毒細(xì)胞

5、內(nèi)培養(yǎng)、特異抗原抗體檢測(cè)、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)和病毒核酸檢測(cè)等等。近年來(lái)，隨著聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，核酸快速檢測(cè)技術(shù)日臻完善[7-9]。
　　實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)是建立在聚合酶鏈技術(shù)基礎(chǔ)上的一項(xiàng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它可以實(shí)現(xiàn)DNA模板擴(kuò)增過(guò)程的全程可視化，而不是像傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)一樣，只能在反應(yīng)結(jié)束后才可觀察到結(jié)果。同時(shí)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA模板濃度的定量。通?？梢酝ㄟ^(guò)兩個(gè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種是在反應(yīng)體系中加入與任一雙鏈D

6、NA都可以結(jié)合的非特異性熒光染料；另一種是設(shè)計(jì)標(biāo)記有發(fā)光基團(tuán)并可以與檢測(cè)核酸特異性結(jié)果的探針，只在檢測(cè)核酸存在的情況下與之結(jié)合。在病毒的核酸檢測(cè)中，我們可以通過(guò)設(shè)計(jì)待檢病毒的特異性引物、探針，實(shí)現(xiàn)病毒的快速檢測(cè)及定量分析。
　　然而，病毒感染性疾病通常暴發(fā)于條件比較艱苦，缺乏實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的偏遠(yuǎn)地區(qū)，這些地區(qū)一般無(wú)法提供實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)所必須的儀器設(shè)備和試劑，這也體現(xiàn)出了實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)的局限性。因此，我們?cè)噲D尋找一種可以用于

7、現(xiàn)場(chǎng)及非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的快速核酸檢測(cè)技術(shù)，以期它可以在現(xiàn)場(chǎng)及偏遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行病毒核酸快速檢測(cè)。
　　重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。在37-42℃條件下，10-15min能夠完成核酸的擴(kuò)增。在這種新型的等溫核酸擴(kuò)增體系中，重組酶體系幫助單鏈引物與DNA雙鏈模板中的互補(bǔ)序列結(jié)合，啟動(dòng)核酸擴(kuò)增過(guò)程，無(wú)需解鏈、退火過(guò)程，因此實(shí)現(xiàn)核酸的等溫?cái)U(kuò)增。同

8、時(shí)，通過(guò)T4噬菌體uvsX蛋白與ATP的結(jié)合與釋放，建立動(dòng)態(tài)反應(yīng)環(huán)境，來(lái)平衡單鏈引物復(fù)合體與新合成核酸，達(dá)到整個(gè)反應(yīng)的持續(xù)指數(shù)擴(kuò)增。經(jīng)探索，發(fā)現(xiàn)在體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以實(shí)現(xiàn)一步法RNA擴(kuò)增，利于RNA病毒核酸擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增完成后，我們可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方式觀察結(jié)果，也可以通過(guò)向反應(yīng)體系加入一條特異性熒光探針的方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀察。因此我們可以通過(guò)檢測(cè)樣品中目的核酸片段，來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的病毒檢測(cè)。由于是等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，因此免去了聚合酶鏈技

9、術(shù)中循環(huán)變溫加熱器等大型設(shè)備的使用。這些優(yōu)點(diǎn)使得利用重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)建立快速、低耗的現(xiàn)場(chǎng)病毒核酸檢測(cè)技術(shù)成為可能。
　　RPA技術(shù)在2006年由劍橋大學(xué)的Olaf Piepenburg、ColinH.Williams、Derek L.Stemple等人建立，僅有約10年的發(fā)展歷史，是一項(xiàng)較新的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)很好地解決了在缺少大型溫度調(diào)節(jié)設(shè)備或者現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境下無(wú)法進(jìn)行核酸擴(kuò)增及后續(xù)分析的難題。僅需利用一臺(tái)1kg的熒光檢測(cè)儀配

10、備筆記本電腦即可實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)觀察或利用37-42℃恒溫箱配備膠體金試紙條實(shí)現(xiàn)病毒檢測(cè)。
　　裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒(armored RNA virus-like particle)技術(shù)是一種RNA陽(yáng)性對(duì)照品制備技術(shù)。利用該技術(shù)制備出的陽(yáng)性對(duì)照品中含有檢測(cè)目的片段的RNA序列，相比于滅活病毒更安全，相比于質(zhì)粒對(duì)照品更能準(zhǔn)確反映檢測(cè)體系。它的原理是利用基因工程方法將大腸桿菌MS2噬菌體外殼蛋白基因序列、檢測(cè)目的片段基因序列克隆到表

11、達(dá)載體上。載體通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將目的片段逆轉(zhuǎn)錄為RNA，同時(shí)表達(dá)出MS2外殼蛋白，將逆轉(zhuǎn)錄的RNA包裹裝配成球形病毒樣顆粒。這樣的病毒樣顆粒保護(hù)了其內(nèi)部的RNA免受RNase的破壞。
　　本研究利用RPA技術(shù)建立蜱傳腦炎病毒，扎伊爾型埃博拉病毒，中東呼吸綜合征冠狀病毒三種RNA病毒核酸快速檢測(cè)方法，并通過(guò)與實(shí)時(shí)定量PCR相比較的方式驗(yàn)證了所建立檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。第一，在蜱傳腦炎病毒RPA檢測(cè)方法的建立中，針對(duì)于病毒序列3’非編碼

12、區(qū)保守序列進(jìn)行引物、探針設(shè)計(jì)；建立了兩步法RT-RPA檢測(cè)方法；利用三種逆轉(zhuǎn)錄酶建立了兩步法RT-qRPA檢測(cè)方法并進(jìn)行了檢測(cè)體系的優(yōu)化；利用五種逆轉(zhuǎn)錄酶建立一步法RT-qRPA檢測(cè)方法并進(jìn)行了檢測(cè)體系的優(yōu)化；并利用活病毒及本研究中制備的陽(yáng)性對(duì)照品對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行了靈敏性驗(yàn)證，同時(shí)利用黃病毒屬其他病毒的RNA對(duì)檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證；最后，利用本研究中建立的一步法RT-qRPA檢測(cè)方法對(duì)54份蜱傳腦炎疑似臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，同

13、時(shí)利用RT-qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)了此批樣本，對(duì)兩者檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。第二，在扎伊爾型埃博拉病毒RPA檢測(cè)方法的建立中，針對(duì)于病毒序列NP蛋白保守序列設(shè)計(jì)引物、探針；建立了兩步法RT-qRPA檢測(cè)方法；利用陽(yáng)性質(zhì)粒驗(yàn)證檢測(cè)體系靈敏度；利用出血熱癥候群病毒RNA對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行了特異性驗(yàn)證。第三，在中東呼吸綜合征冠狀病毒RPA檢測(cè)方法的建立中，分別針對(duì)于病毒序列開(kāi)放閱讀框5與E蛋白之間的序列（upE）及N蛋白序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物、探針

14、對(duì)；利用兩種逆轉(zhuǎn)錄酶建立一步法RT-qRPA檢測(cè)方法；制備了針對(duì)于兩個(gè)不同檢測(cè)目的片段的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照品；并利用該陽(yáng)性對(duì)照品對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證；利用其它病毒RNA及SARS冠狀病毒陽(yáng)性質(zhì)粒及本研究中建立的陽(yáng)性對(duì)照品驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。
　　建立的兩步法TBEV RT-qRPA檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)10-2TCID50；一步法TBEV RT-qRPA檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)10-2TCID50，1.8拷貝/體系；54份蜱傳腦炎臨床

15、疑似樣本檢測(cè)結(jié)果顯示與現(xiàn)行RT-qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果相比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明檢測(cè)體系可靠。建立的兩步法ZEBOV RT-qRPA檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)100拷貝/體系。一步法MERS-CoV-upE RT-qRPA檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)4拷貝/體系；一步法MERS-CoV-upE RT-qRPA檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)1拷貝/體系。同時(shí)檢測(cè)結(jié)果顯示，所建立的檢測(cè)體系特異性好，不發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究中，所制備的裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒陽(yáng)性對(duì)照品在電

16、鏡下可見(jiàn)直徑25nm左右的球形顆粒。
　　本研究建立了針對(duì)蜱傳腦炎病毒的RPA快速核酸檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)驗(yàn)證所建立的檢測(cè)體系可以檢測(cè)到濃度為10-2TCID50的活病毒，同時(shí)可以檢測(cè)到單拷貝的含目的片段的陽(yáng)性對(duì)照品，較針對(duì)于同一目的片段的RT-qPCR檢測(cè)方法靈敏度高（10-2TCID50，380拷貝/體系）。此外，針對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒，同樣建立了RPA核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，分別可以檢測(cè)到100拷貝、單拷貝的相