環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)檢測三種典型腸病毒方法的建立及其在水環(huán)境中的應(yīng)用.pdf

1、隨著水環(huán)境日益惡化，水污染問題己成為關(guān)注的焦點和研究的熱點?，F(xiàn)已有許多由于飲用水受到病原微生物污染而導(dǎo)致大范圍群感染致病的記載，通過水傳播的病原微生物以細菌、病毒和原生動物為主，常規(guī)氯消毒可有效殺滅細菌，但病毒在水環(huán)境中存活力很強，常規(guī)水處理工藝不能有效的將其去除。因此，檢測環(huán)境水體中病毒是預(yù)防疾病暴發(fā)、評估水源衛(wèi)生質(zhì)量和環(huán)境衛(wèi)生狀況的一項很有價值的工作。本文新建了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)用于檢測水環(huán)境中三種引起腹瀉典型腸病毒，設(shè)計了每種病毒

2、的專用引物，分別對其擴增條件（鎂離子濃度、甜菜堿濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度）進行了優(yōu)化，并檢測了其特異性及靈敏度。然后將優(yōu)化之后的LAMP檢測方法用于北京飲用水及再生水中三種典型腸病毒的檢測。具體結(jié)論如下：
　　 1.星狀病毒LAMP最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為4mmol/L、甜菜堿終濃度為1mol/L的25μL體系下65℃反應(yīng)90min。對擴增終產(chǎn)物進一步進行酶切分析得到的條帶大小與預(yù)期的結(jié)果（84和135bp）吻合，以星狀病

3、毒、輪狀病毒及諾如病毒為模板進行特異性測試亦沒有發(fā)生交叉反應(yīng)說明其特異性較好。分別用LAMP及PCR方法檢測等倍稀釋后的星狀病毒質(zhì)粒，靈敏度達到5.04copies/μL和5.04×10copies/μL，比PCR高出10倍。
　　 2.輪狀病毒LAMP最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為3mmol/L、甜菜堿終濃度為1mol/L的25μL體系下65℃反應(yīng)90min。對擴增終產(chǎn)物進一步進行酶切分析得到的條帶大小與預(yù)期的結(jié)果(280bp

4、、193bp和78bp)吻合，以輪狀病毒、星狀病毒及諾如病毒為模板進行特異性測試亦沒有發(fā)生交叉反應(yīng)說明其特異性較好。分別用LAMP及PCR方法檢測等倍稀釋后的輪狀病毒質(zhì)粒，靈敏度達到5.08copies/μL和5.08×102copies/μL，比PCR高出100倍。
　　 3.諾如狀病毒LAMP最佳反應(yīng)條件為：鎂離子終濃度為4mmol/L、甜菜堿終濃度為10mmol/L的25μL體系下63℃反應(yīng)90min。對擴增終產(chǎn)物進一步進

5、行酶切分析得到的條帶大小與預(yù)期的結(jié)果（179bp，239bp和299bp）吻合，以諾如病毒、星狀病毒及輪狀病毒為模板進行特異性測試亦沒有發(fā)生交叉反應(yīng)說明其特異性較好。分別用LAMP及PCR方法檢測等倍稀釋后的諾如病毒質(zhì)粒，靈敏度達到2.168copies/μL和2.168×102copies/μL，比PCR高出100倍。
　　 4.將改良后的RT-LAMP方法用于檢測水環(huán)境中三種典型腸病毒，檢出率分別為：飲用水（星狀病毒未檢出、