建立同時(shí)檢測(cè)三種真菌毒素膜免疫芯片方法的研究與抗慶大霉素多克隆抗體的制備.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：
　　 1、建立同時(shí)檢測(cè)三種真菌毒素膜免疫芯片方法的研究
　　 真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物,主要污染糧食及飼料等,一旦通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后,將可能造成致癌、致畸和致突變等嚴(yán)重危害。目前比較常見(jiàn)的檢測(cè)方法有薄層層析法、高效液相色譜法和ELSIA等。膜免疫芯片技術(shù)是指將抗原或抗體固定于膜載體上的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),不僅簡(jiǎn)單快速、可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì),而且結(jié)果易于判讀,特

2、別適合于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)室已制備出黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和玉米赤霉烯酮(Zearelenone,ZEN)三種真菌毒素檢測(cè)抗原及其相應(yīng)單克隆抗體的基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)將抗原固定于膜載體,根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)免疫學(xué)原理,建立了可同時(shí)并能定性檢測(cè)三種真菌毒素的膜免疫芯片方法。結(jié)果如下:
　　 (1)AFB1、OTA和ZEN膜免疫檢測(cè)方法的研究
　　

3、 以PVDF膜為固相載體,采用一種新型的、簡(jiǎn)單的點(diǎn)樣方法,對(duì)點(diǎn)樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式分別進(jìn)行了優(yōu)化,確定了以Tris-HCl緩沖液(含10％甘油和0.1％海藻糖,pH8.5)為點(diǎn)樣緩沖液、37℃濕盒孵育2 h、5％脫脂牛奶封閉1 h為最佳反應(yīng)條件,在此基礎(chǔ)之上確定了:AFB1檢測(cè)抗原點(diǎn)陣濃度為125μg/mL、抗AFB1單克隆抗體濃度為1/2000時(shí),AFB1檢測(cè)閾值為2.0ng/mL；OTA檢測(cè)抗原點(diǎn)陣濃度為10μg/mL

4、、抗OTA單克隆抗體濃度為1/5000時(shí),OTA檢測(cè)閾值為2.0 ng/mL；ZEN檢測(cè)抗原點(diǎn)陣濃度為40μg/mL、抗ZEN單克隆抗體濃度為1/5000時(shí),ZEN檢測(cè)閾值為3.0ng/mL。
　　 (2)同時(shí)檢測(cè)AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片方法的建立
　　 在研究結(jié)果(1)的基礎(chǔ)上,建立了同時(shí)檢測(cè)AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片的方法,該方法對(duì)AFB1/OTA/ZEN三種真菌毒素的檢測(cè)閾值為2.0/2.0/3.

5、0ng/mL,20％的甲醇濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)有明顯影響。同時(shí),研究了膜免疫芯片的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等,該方法制備的膜免疫芯片與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬菌素B1無(wú)明顯交叉反應(yīng),批內(nèi)和批間重復(fù)均未見(jiàn)檢測(cè)閾值改變,膜免疫芯片于4℃保存90后用于檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)明顯變化。
　　 (3)實(shí)際樣品檢測(cè)
　　 用本研究所制備的膜芯片對(duì)12份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),肉眼判讀結(jié)果,檢出3份AFB1陽(yáng)性超標(biāo)樣品和4份ZEN陽(yáng)性超標(biāo)樣品,其中

6、AFB1和ZEN同時(shí)超標(biāo)的樣品有2份,未檢出OTA陽(yáng)性超標(biāo)樣品。其結(jié)果與三種真菌毒素商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 2、抗慶大霉素多克隆抗體的制備
　　 氨基糖苷類抗生素是一類應(yīng)用廣泛的廣譜抗菌藥物,主要包括慶大霉素(Gentamicin,GM)、鏈霉素和卡那霉素等,常用作獸醫(yī)臨床治療及飼料添加劑,不規(guī)范用藥會(huì)引起畜產(chǎn)品、尤其是牛奶中的藥物殘留,對(duì)人類的健康構(gòu)成危害。因此,對(duì)該類藥物進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)是預(yù)防和控制其

7、危害的有效手段。本研究進(jìn)行了抗慶大霉素多克隆抗體的制備研究,旨在建立抗慶大霉素的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
　　 結(jié)果：如下:
　　 采用碳化亞胺(EDC)法合成慶大霉素的免疫抗原(GM-BSA),用戊二醛法合成慶大霉素的檢測(cè)抗原(GM-GA-OVA),經(jīng)SDS-PAGE初步鑒定兩種抗原合成成功。用免疫抗原GM-BSA免疫9只Balb/C小鼠,經(jīng)四次加強(qiáng)免疫后,間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),9只老鼠的血清均產(chǎn)生了較高的效價(jià),最高可達(dá)1: