三種食源性病毒RT-PCR-反向斑點雜交檢測方法的建立.pdf

1、食源性病毒是引起食源性疾病的主要原因之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，發(fā)達國家每年約有30％的人口患食源性疾病，而在發(fā)展中國家每年患腹瀉及相關疾病的患者約有2.7億，導致240萬5歲以下兒童死亡。輪狀病毒(Rotavrius，RV)、諾如病毒(Norovirus，NV)和甲型肝炎病毒(HapatitisA virus，HAY)是三種常見的食源性病毒，主要通過糞一口途徑在人與人之間傳播，水和食品污染病毒是它們最主要的傳播方式。
　　 輪狀病毒、

2、諾如病毒和甲型肝炎病毒均為RNA病毒。目前世界上對這三種病毒的檢測方法主要為電鏡法、ELISA法和RT-PCR法。但由于電鏡法價格昂貴，對環(huán)境及操作人員要求較高；ELISA的靈敏度不及RT-PCR，使得RT-PCR成為目前檢測輪狀病毒、諾如病毒和甲型肝炎病毒的“金標準”。本研究通過建立RT-PCR擴增與反向斑點雜交檢測相結合的方法，實現(xiàn)對三種病毒的同步檢測，即在RT-PCR擴增之后利用反向斑點雜交方法對結果進行檢測。該方法不但能有效提高

3、檢測靈敏度、降低“假陽性”風險，且檢測方法無需任何儀器、價格低廉、檢測結果肉眼可見，可用于對食品、糞便的快速定性篩查。論文主要研究內容及結果如下：
　　 (1)采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒法對病毒RNA進行提取。以GII型諾如病毒的RNA依賴性的RNA聚合酶基因(RdRp)、輪狀病毒的A組內衣殼蛋白VP6基因和甲肝病毒的VPI～VP3結構蛋白基因為擴增對象，建立RT-PCR同時擴增這三種病毒的方法

4、。通過對擴增反應中引物濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)的優(yōu)化得到RT-PCR同時擴增RV、NV和HAV的最佳反應條件。并測得在此條件下利用瓊脂糖凝膠電泳法分析擴增結果的最低檢測限為：279.3pg(RV)、93.7pg(NV)、117.3pg(HAV)。
　　 (2)回收輪狀病毒、諾如病毒和甲肝病毒的RT-PCR擴增產物，經(jīng)純化后用于構建重組質粒pGEM-RV、pGEM-NV、pGEM-HAV。利用PCR及測序方法對克隆產物進行檢驗分析，

5、并將克隆產物作為模板用于反向斑點雜交優(yōu)化試驗中。
　　 (3)通過對反向斑點雜交反應過程中雜交膜、堿性磷酸酶的稀釋度、RT-PCR產物加入量、紫外交聯(lián)時間、預雜交時間、雜交時間、雜交后洗膜時間及溫度、酶促反應時間、酶促后洗膜時間和雜交溫度的探索及優(yōu)化建立了反向斑點雜交技術同時檢測輪狀病毒、諾如病毒和甲肝病毒的方法。通過靈敏度試驗得到該方法同時檢測RV、NV、HAV的最低檢測限。RV與NV的最低檢測限分別為27.93pg和9.37

6、pg，高于RT-PCR-凝膠電泳法10倍；HALV的最低檢測限為1.173pg，高于RT-PCR-凝膠電泳法100倍。且雜交穩(wěn)定性、特異性良好，無交叉反應。
　　 (4)采集7份臨床樣本對本研究所建立的RT-PCR-反向斑點雜交法的有效性進行了驗證，并與RT-PCR-凝膠電泳法進行對比。結果表明，RT-PCR-反向斑點雜交法對于RV、NV和HAV三種食源性病毒的檢測可靠有效，檢測結果與RT-PCR-凝膠電泳法一致，其中6份樣本呈