斑點雜交法檢測sen病毒感染

1、<p>　　斑點雜交法檢測SEN病毒感染</p><p>　　作者：楊群，田德英，許東，葛婭，任星峰，宋佩輝 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 聚合酶鏈反應(yīng) </p><p>　　【Abstract】 AIM: To explore the availability of dotblot assay in the detection of S

2、EN virus infection. METHODS: Nuclear acid was extracted from serum specimens, and dotblot analysis and polymerase chain reaction(PCR) were carried out respectively to detect SENV DNA. RESULTS: Among 191 samples, 6 wer

3、e found positive by dotblot, and 11 were found positive by PCR. CONCLUSION: The probe prepared by us is SENVspecific. Dotblot hybridization with DIGlabeled SENV DNA probe can be used to detect</p><p>　　【Key

4、words】 SEN virus; dotblot; polymerase chain reaction </p><p>　　【摘要】 目的： 探討斑點雜交法檢測SEN病毒（SENV）感染的應(yīng)用價值. 方法： 應(yīng)用地高辛標(biāo)記、制備SENV部分基因探針并用斑點雜交技術(shù)檢測SENV DNA，與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測結(jié)果相比較. 結(jié)果： 在191份血清中，采用斑點雜交法檢出6份陽性，檢出率為3.1%.

5、PCR方法檢測出11份陽性，陽性率5.8%. 結(jié)論： 制備的地高辛探針具有SENV特異性，以地高辛標(biāo)記的SENV探針可用于檢測SENV感染. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 SEN病毒；斑點雜交；聚合酶鏈反應(yīng) </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　目前，國外對SENV基因組研究表明，SENV可分為SENVA至S

6、ENVH 8個亞型，各亞型間基因序列差異在15%~50%之間，各亞型與TTV原型株間基因序列差異為40%~60%［1］. 盡管國內(nèi)外學(xué)者對SENV感染進(jìn)行了不少報道，但是仍然沒有給出SENV的感染復(fù)制場所的直接證據(jù)［2，3］. 我們進(jìn)行了地高辛標(biāo)記SENV探針的研究并評價其對SENV DNA直接檢測的應(yīng)用價值. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p>&l

7、t;p>　　1.1材料系1997/1998收集的191例不同人群血清標(biāo)本，包括慢性乙型肝炎患者、重癥肝炎患者、非甲~非戊肝炎患者、血漿置換患者、靜脈吸毒者和正常人群. 所有血清樣本采集后于-70℃冰箱保存. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1SEN病毒核酸探針的制備選擇SENV開放閱讀框2(ORF2)4區(qū)域設(shè)計、由

8、上海博亞生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物. 外引物為: Sense primer: 5′GAGTTTACACACCGCAG3′ Antisense primer: 5′ GTCTTATGTACCGTCTCC3′；內(nèi)引物為： Sense primer: 5′GGTGGCACGGGATCCAAAAATGCACTTTTC3′ Antisense primer: 5′GGTGGCACG GATCCTAAAAATGCACTTTTC3′. 通過套式

9、PCR反應(yīng)從患者血清中擴(kuò)增得到長511 bp片段，連接pRSETB載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌. 在挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定后擴(kuò)增重組質(zhì)粒，以BamHⅠ單酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，取1 μg以博士德公司地高辛DNA標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，操作按試劑盒說明書進(jìn)行. </p><p>　　1.2.2血清樣品DNA的提取病毒核酸抽提試劑為美國Biotronics公司Acupure DNA/RNA提取試劑盒,

10、取50 μL血清加100 μL裂解液充分混勻，80℃溫浴10 min,取出室溫平衡5 min，加150 μL異丙醇混勻，經(jīng)15 000 g 10 min離心沉淀，去除上清液，加50 μL 700 mL/L乙醇試劑洗滌沉淀,再離心去除上清液，室溫風(fēng)干，加50 μL樣品稀釋液重懸樣品，80℃溫浴5 min,離心后將上清液備用. </p><p>　　1.2.3PCR檢測取各份提取核酸5 μL作為模板加入第1次PCR反

11、應(yīng)體系. 50 μL反應(yīng)體系中鎂離子終濃度為15 mmol/L, dNTP終濃度各為200 μmol/L, Taq P為2 u，外引物各為50 pmol，以94℃變性3 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；取第1次PCR產(chǎn)物2 μL加入第2次PCR反應(yīng)體系，50 μL反應(yīng)體系中內(nèi)引物各為50 pmol，余同第1次PCR,循環(huán)參數(shù)同第1次PCR，共進(jìn)行30個循環(huán). PCR結(jié)束后收產(chǎn)物加于80 g/L聚丙烯酰胺

12、凝膠電泳，預(yù)期PCR產(chǎn)物應(yīng)為511 bp. </p><p>　　1.2.4斑點雜交取各份提取核酸20 μL及定量系列稀釋重組質(zhì)粒，煮沸10 min后立即置于冰浴，加入等體積20×SSC，點樣于硝酸纖維素膜上，以真空泵抽吸，80℃烤膜2 h，參照試劑說明書進(jìn)行雜交及鏈酶親合素生物素過氧化物酶復(fù)合物(SABCPOD),顯色. 探針濃度為25 μg/L. </p><p><b

13、>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1斑點雜交檢測結(jié)果檢測標(biāo)本共191份，其中6份為陽性，陽性率為3.1%. 在同一張硝酸纖維素膜上，同時點上定量倍比稀釋的SENV重組質(zhì)粒（分別為625.0, 125.0, 25.0, 5.0, 1.0,0.2和0.04 pg），在質(zhì)粒1.0 pg（換算成SENV DNA拷貝數(shù)相當(dāng)于2.7×105）時可看到較明顯的陽性斑點(Fig 1).

14、</p><p>　　2.2PCR檢測結(jié)果PCR方法檢測血清標(biāo)本共191份，其中擴(kuò)增出11份陽性，陽性率5.8%（Fig 2）. </p><p>　　2.3斑點雜交與PCR結(jié)果比較在191份血清中，采用斑點雜交法檢出6份陽性血清， PCR方法檢測出11份陽性. 11份PCR陽性者中5份斑點雜交陽性；另外6份PCR陽性者，斑點雜交為陰性. 1份PCR為非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物者，斑點雜交為陽性，后

15、經(jīng)TTVDNA PCR檢測為陽性. </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　SENV是一組無包膜、單鏈、環(huán)狀的小DNA病毒，其基因組長度約為3900個核苷酸. 從生物物理特征、基因組序列及其編碼蛋白分析結(jié)果來看，SENV和TTV（輸血傳播病毒）原型株的序列同源性為50%，氨基酸同源性僅為3%，提示SENV不是TTV的變異株，而是從同一共同的

16、祖先進(jìn)化而來的、不完全相同的病毒組群，屬于TTV超家族［1］. 和TTV相似，SENV主要經(jīng)輸血或靜脈注射毒品傳播. 在美國志愿獻(xiàn)血者SENVD和SENH的感染率為1.8%，住院患者感染率為2.8%，提示人群感染率為2%~3%［2］. 國內(nèi)最近報道，我國北方人群SENV感染率較國外要高的多（正常人群感染率為62.5%）［4，5］. 其原因除了有SENV感染的地區(qū)人群差異外，還可能與所用的PCR檢測條件的差異有關(guān). 因此建立特異性、直接檢

17、測SENV DNA的雜交方法十分必要. </p><p>　　我們采用地高辛標(biāo)記SENV部分基因制備成雙鏈DNA探針，在探針濃度為25 μg/L時，在同一張硝酸纖維素膜上，同時點上定量倍比稀釋的SENV重組質(zhì)粒，檢測靈敏度可達(dá)1.0 pg，換算成SENV DNA拷貝數(shù)相當(dāng)于2.7×105. 對191份血清采用斑點雜交法檢出6份陽性血清，檢出率為3.1%；PCR方法檢測出11份陽性. 11份PCR陽性者中

18、5份斑點雜交陽性；另外6份PCR陽性者，斑點雜交為陰性. 1份PCR為非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物者，斑點雜交為陽性，后經(jīng)TTVDNA PCR檢測為陽性. 斑點雜交和PCR相比較，靈敏度要低于后者，但是對于PCR擴(kuò)增出非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物不易確定陽性和陰性時，采用斑點雜交有助于特異性的鑒別，而且斑點雜交也可作為一種半定量的核酸檢測技術(shù)，在病毒感染與臨床表現(xiàn)相互關(guān)系的研究中有獨特的優(yōu)勢. </p><p>　　我們制備了地高辛標(biāo)記

19、的SENV特異性探針，建立了SENV感染的斑點雜交檢測法，為下一步SENV感染部位、復(fù)制場所及其致病性的研究奠定了基礎(chǔ). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Tanaka Y, Primi D, Wang RH, et al. Genomic and molecular evolutionary analysis of a

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