鼠抗禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒gp90多抗的研制及gp90在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、第一章禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒gp90在大腸桿菌中的表達(dá)及鼠抗REV-gp90多抗的研制 將含按正確的閱讀框定向克隆進(jìn)pGEX-6P-1載體中谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的下游的gp90基因的重質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中，在37度0.5mMIPTG誘導(dǎo)下，gp90基因以融合蛋白的形式獲得了良好的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，證實(shí)gp90基因以融合蛋白的形式得到良好的表達(dá)，且其表達(dá)的融合蛋白的大小為64KD。將包涵體變

2、性、復(fù)性處理以后，回收免疫老鼠，所得多抗可與REV-SNV株感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中起反應(yīng)。這表明，大腸桿菌BL21表達(dá)的SNV株gp90蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。 第二章禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒gp90基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 將REV-SNV株gp90基因用EcoRI和Sall從重組原核質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp90雙酶切，回收后，亞克隆到載體pFastBac1中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFast

3、Bac1-gp90；轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌，通過(guò)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座作用將gp90基因整合到Bacmid穿梭載體中。在含慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板上篩選發(fā)生轉(zhuǎn)座的白色菌落，提取DNA,獲得重組穿梭載體Bacmid-gp90；將重組穿梭載體Bacmid-gp90用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得了含有REV-SNV株gp90基因的重組桿狀病毒rBac-gp90(rgp90)。重組病毒感染Sf9

4、細(xì)胞后，用IFA方法對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：構(gòu)建的重組桿狀病毒能夠在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)REV-SNV株的gp90蛋白。 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)是禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的病原，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科的C型病毒。該病毒主要感染火雞，也能引起雞、鴨等禽類以淋巴-網(wǎng)狀細(xì)胞增生為特征的腫瘤性的病理綜合征。主要侵害宿主的淋巴細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞，嚴(yán)重影響宿主免疫系統(tǒng)的功能，誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫抑制，降低機(jī)體對(duì)其它病原或抗原的免疫應(yīng)答

5、，導(dǎo)致不同程度的繼發(fā)、二重感染和多重感染，減弱雞群對(duì)各種疫苗的免疫力，加劇某些疾病的臨床表現(xiàn)。目前REV在我國(guó)的流行越來(lái)越嚴(yán)重，在某些雞場(chǎng)中對(duì)REV陽(yáng)性抗體的檢出率高達(dá)21.4％-71％，其中出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)的雞群對(duì)REV抗體的陽(yáng)性檢出率要比正常雞群高的多。 GP90是REV病毒env基因編碼的表面囊膜糖蛋白，是病毒的主要免疫蛋白，含有順序和構(gòu)象表位，具有受體結(jié)合功能，能誘導(dǎo)感染宿主產(chǎn)生較高水平的保護(hù)性抗體。對(duì)不同地區(qū)不同時(shí)間分

6、離的REV全基因組測(cè)序表明，env基因序列同源性在92％以上，其不同主要由編碼gp90的基因引起，提示gp90可能與病毒的變異、毒力、致病性、致病機(jī)理等有關(guān)。 本研究將含有經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切和基因測(cè)序鑒定正確的gp90基因的重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp90轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21中，在37℃0.5mMIPTG誘導(dǎo)下，gp90基因以融合蛋白的形式獲得了良好的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，證實(shí)其表達(dá)的融合蛋白的大

7、小為64KD,表達(dá)形式為包涵體。通過(guò)包涵體純化的方法，將獲得的較高純度的融合蛋白，免疫小白鼠所得多抗可與REV感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行反應(yīng)。這表明，體外大腸桿菌表達(dá)的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。 將REV-gp90基因用EcoRI和SalI從重組原核質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp90雙酶切，回收后，亞克隆到載體pFASTBAC1中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFASTBAC1-gp90

8、；轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)大腸桿菌，通過(guò)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座作用將gp90基因整合到Bacmid穿梭載體中。在含慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板上篩選發(fā)生轉(zhuǎn)座的白色菌落，提取DNA,獲得重組穿梭載體Bacmid-gp90；將重組穿梭載體Bacmid-gp90用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得了含有REV-SNV株gp90基因的重組桿狀病毒rBac-gp90(rgp90)。重組病毒感染Sf9細(xì)胞4天后，以上述