苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64蛋白在酵母細胞中的表達.pdf

1、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是多角體桿狀病毒科的典型代表，能感染30多種鱗翅目昆蟲，該病毒的基因組是由大小為134kb的環(huán)狀單一雙鏈DNA分子組成。感染宿主后的核型多角體病毒有兩種表型：一種為包涵體病毒(ODV)，另一種則為非包涵體病毒(BV)。目前只在BV顆粒中發(fā)現(xiàn)Gp64蛋白，分子量為6 kD。Gp64蛋白是第三類過濾性的膜融合蛋白，主要以二硫鍵相連三聚體的形式存在于桿狀病毒BV的一端，在病毒感染的早期和晚期均能表達這

2、個蛋白，它是病毒進入宿主細胞的關鍵功能蛋白之一。Gp64蛋白作為桿狀病毒BV上的囊膜蛋白，在內吞途徑進入細胞中，對結合宿主細胞受體和調節(jié)低 pH引發(fā)膜融合有重要作用。同時Gp64蛋白也是病毒萌芽和后代產生所必需的。本實驗將Gp64基因克隆到原核表達系統(tǒng)中，得到重組Gp64蛋白，利用純化的Gp64蛋白通過免疫大白兔實驗獲得了Gp64蛋白抗體，用來檢測Gp64基因在酵母細胞中的表達。
　　1．苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64基因在大

3、腸桿菌中的表達：以AcMNPV Bacmid質粒為模板，參照NCBI上所給出的Gp64蛋白基因組序列，設計一對引物，并在其上下游分別添加EcoR I和Sal I酶切位點。PCR擴增出全長的Gp64基因。所得的PCR產物經測序驗證后用EcoR I和Sal I酶切后與經EcoR I和Sal I酶的同尾酶Xba I酶同樣處理的pET28a(+)原核表達載體連接，命名pET28a-Gp64。挑取陽性克隆，抽提質粒，經酶切鑒定和測序驗證后，轉化到

4、于E.coli野生型BL21表達菌中，利用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE檢測Gp64蛋白基因在大腸桿菌中沒有表達。
　　2．苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒截短Gp64基因在大腸桿菌中的表達：以AcMNPV Bacmid質粒為模板，參照NCBI上給出的Gp64全基因組序列及已報到跨膜區(qū)域的相關序列來切除下游跨膜區(qū)域以確定截短序列。采用與之前相同的方法設計引物，添加相同的酶切位點，PCR擴增后得到截短Gp64基因，PCR產物和pE

5、T28a(+)原核表達載體通過酶切后進行連接反應，重組子命名為pET28a-截短Gp64。挑取陽性克隆，抽提質粒，經酶切鑒定和測序驗證后，轉化到于E.coli野生型BL21表達菌中用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE檢測Gp64基因在大腸桿菌中表達的重組蛋白大小約為40kD。對目的蛋白表達條件進行優(yōu)化，對收獲的目的蛋白進行電透析純化，得到純度較高的目的蛋白，割膠免疫大白兔，收獲Gp64蛋白抗體。
　　3．苜蓿銀紋夜蛾核型多角體

6、病毒Gp64基因在釀酒酵母中的表達：以AcMNPV Bacmid質粒為模板，參照NCBI上給出的Gp64蛋白基因組序列，設計一對引物，并在其上下游添加了EcoR I和Sal I酶切位點，PCR擴增后得到Gp64基因。所得的PCR產物用EcoR I和Sal I酶切后與經相同酶處理的pGBKT7酵母表達載體進行連接反應，得到的重組子命名 pGBKT7-Gp64。挑取陽性克隆，抽提質粒，經酶切鑒定和測序驗證后，轉化到于釀酒酵母表達菌AH109