斜紋夜蛾核多角體病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(apoptosis)，細(xì)胞凋亡作為一種宿主范圍決定因子限制了桿狀病毒的殺蟲范圍，影響桿狀病毒殺蟲劑在生物防治中的應(yīng)用：然而，在長期進(jìn)化過程中，桿狀病毒獲得了抗凋亡基因以阻止細(xì)胞凋亡，使其能夠正常復(fù)制。在已測序的桿狀病毒中絕大部分都包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的抗凋亡基因，但是部分體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，并不是所有抗凋亡基因都具有抗細(xì)胞凋亡活性。本研究首次利用RN Ai技術(shù)對斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodoptera

2、litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)中兩個(gè)抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受納宿主中的抗凋亡功能進(jìn)行研究，通過瞬時(shí)表達(dá)檢測探討兩個(gè)基因在SpltNPV非受納宿主中的抗凋亡功能，同時(shí)對抗凋亡基因與其宿主的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下： PCR擴(kuò)增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因，分別將其連接到含有兩個(gè)反向T7啟動子的質(zhì)粒載體上，體外轉(zhuǎn)錄得到大

3、片段的雙鏈RNA (double strain RNA，dsRNA)，將dsRNA分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221細(xì)胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49，或者同時(shí)沉默Splt-iap4和Splt-p49的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察、DNA ladder檢測、細(xì)胞存活率計(jì)算以及病毒滴度測定，結(jié)果說明SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞時(shí)，Splt-P49具有抗凋亡功能，而Splt-IAP不具有這種功能。但實(shí)

4、驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞在48 h之前細(xì)胞會聚集成團(tuán)，而勛Splt-iap4dsgNA處理細(xì)胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象，大部分依然是獨(dú)立的單個(gè)細(xì)胞，推斷Splt-lap4基因在病毒感染期間起到了某種作用使得細(xì)胞的聚集受阻，但Splt-iap4的功能與病毒產(chǎn)生可感染性的子代病毒無關(guān)。 在vAcAnh感染Sf9系統(tǒng)中，分別瞬時(shí)表達(dá)Splt-iap4和Splt-p49兩基因，經(jīng)光學(xué)顯微鏡和細(xì)胞存活率計(jì)算方法檢測，結(jié)果同樣顯

5、示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能，且Splt-IAP無輔助抗凋亡功能或延遲細(xì)胞凋亡功能。最后對桿狀病毒中的抗凋亡基因與其來源宿主進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示親緣關(guān)系相近的桿狀病毒所含的抗凋亡類型也相近，說明抗凋亡基因與桿狀病毒進(jìn)化有著密切的關(guān)系，也可能發(fā)揮著重要作用。 斜紋夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(S. exigua)同屬夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬的昆蟲，親緣關(guān)

6、系很近．且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)基因組相似性很高，但這兩種病毒并不能交叉感染各自宿主。本文從細(xì)胞水平和亞顯微水平對SpltNPV感染非受納宿主離體細(xì)胞Se301的過程進(jìn)行了描述，并對感染失敗的原因進(jìn)行了初步的生化分析。 光學(xué)顯微鏡顯示，被SpltNPV感染的Se301細(xì)胞在感染后24 h至120 h期間細(xì)

7、胞出現(xiàn)了明顯的病理現(xiàn)象，包括細(xì)胞空泡，細(xì)胞聚集等，且隨著時(shí)間的延長病理癥狀越來越嚴(yán)重，但感染細(xì)胞中始終沒有病毒多角體。DAPI染色熒光觀察和電鏡觀察結(jié)果，都表明從24 h至120 h各樣品中均顯示細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡的特征，但未形成晚期凋亡特征的凋亡小體。TCID50檢測表明病毒沒有產(chǎn)生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting顯示，在被感染的Se301細(xì)胞中可完成病毒DNA的復(fù)制；RT-PCR分析也顯示，感染細(xì)胞72 h時(shí)，Sp