細(xì)胞色素C在無細(xì)胞體系中對(duì)斜紋夜蛾細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、細(xì)胞凋亡是當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展為細(xì)胞凋亡的研究提供了有力武器。比如無細(xì)胞體系，在細(xì)胞凋亡的應(yīng)用中有不可取代的優(yōu)越性。無細(xì)胞體系最初主要應(yīng)用于細(xì)胞重大生命活動(dòng)的機(jī)理研究。例如在亞細(xì)胞水平和分子水平上研究細(xì)胞核的體外重建、細(xì)胞周期的調(diào)控等。1993年，lazebnik等科學(xué)家首次將其應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的研究。無細(xì)胞體系在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞凋亡的應(yīng)用中已經(jīng)取得了很多成果，但在昆蟲細(xì)胞凋亡的應(yīng)用中還正在深入。本文應(yīng)用無細(xì)

2、胞體系對(duì)昆蟲細(xì)胞凋亡的有關(guān)方面進(jìn)行了探討和研究。我們以前的研究結(jié)果已證明，桿狀病毒中的芹菜夜蛾核型多角體病毒SfMNPV和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV誘導(dǎo)的斜紋夜蛾（Spodoptera litura） S1-1細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素C（cytc）從線粒體釋放至胞質(zhì)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)以S1-1細(xì)胞核為研究對(duì)象，用S1-1細(xì)胞漿制備的無細(xì)胞體系作為反應(yīng)體系。在無細(xì)胞體系中以純化的外源cytc作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)S1-1細(xì)

3、胞核發(fā)生凋亡，研究了S1-1胞核凋亡的特征，進(jìn)一步探究了cytc在昆蟲細(xì)胞凋亡中的作用。主要工作包括以下幾個(gè)方面： （1）外源cytc對(duì)S1-1細(xì)胞核的影響 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)判斷是凋亡檢測(cè)的經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)，最為常用及最為簡(jiǎn)便的方法是使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)采用DAPI染料，直接對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化。由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶對(duì)細(xì)胞核染色質(zhì)DNA進(jìn)行特異切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見典型的

4、梯形圖譜。這是細(xì)胞凋亡一個(gè)強(qiáng)有力的生化指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)提取凋亡細(xì)胞核DNA進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)其DNA變化。通過上述兩種方法研究了細(xì)胞色素C誘導(dǎo)S1-1細(xì)胞核發(fā)生凋亡的作用。 結(jié)果表明，一定濃度的外源cytc將無細(xì)胞體系激活為凋亡體系，細(xì)胞核在凋亡體系中，置28℃培養(yǎng)箱，分別孵育2hr，4hr，6hr，8hr。DAPI染色結(jié)果顯示細(xì)胞核固縮并逐漸變形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集并趨邊化，有空泡形成。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞核直至破裂成大量的小塊而被

5、核膜包裹，類似于凋亡體。細(xì)胞核孵育12 hr之后，熒光顯微鏡下幾乎看不到完整的細(xì)胞核，整個(gè)視野中充滿高亮度的細(xì)小的熒光球。這說明cytc可誘導(dǎo)S1-1細(xì)胞核發(fā)生凋亡。提取凋亡細(xì)胞核DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞DNA梯形電泳譜帶，且細(xì)胞核孵育時(shí)間越長(zhǎng)，電泳梯形條帶越明顯。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了cytc可誘導(dǎo)S1-1細(xì)胞核發(fā)生凋亡。 （2） cytc對(duì)caspase-3活性的影響 檢測(cè)細(xì)胞凋亡的另外一個(gè)重要生化指標(biāo)是檢

6、測(cè)胱天蛋白酶的活性。如caspase-3，caspase-8，caspase-9等在細(xì)胞凋亡過程中被激活，由無活性的酶原成為有活性的酶。活化的caspase對(duì)其底物具有特異性切割性，通過這一特性來檢驗(yàn)相應(yīng)的胱天蛋白酶的活性。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光定量技術(shù)檢測(cè)cytc誘導(dǎo)S1-1細(xì)胞核發(fā)生凋亡過程中caspase-3的活性變化。分別在孵育不同時(shí)間的凋亡體系中加入等量的caspase-3的特異性底物Asp-Glu-Val-Asp（DVED），根據(jù)底