苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)pk-1基因的克隆與表達(dá).pdf

1、桿狀病毒是一類有著桿狀病毒粒子的DNA病毒，其基因組為90～180Kb的雙鏈環(huán)狀 DNA。目前，昆蟲病毒研究活躍在病毒研究的各個(gè)領(lǐng)域，占據(jù)著了生命科學(xué)研究的顯著地位，擁有著廣闊的發(fā)展前景。蛋白激酶(Protein kinase,PK)具有將ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定的氨基酸殘基上的潛在催化能力，從而使蛋白質(zhì)磷酸化。在DNA復(fù)制和有絲分裂過程中蛋白激酶起調(diào)節(jié)作用，在轉(zhuǎn)錄過程也起到重要作用。在許多病毒侵染過程中，蛋白激酶和蛋白的磷酸

2、化作用起到至關(guān)重要的作用。病毒粒子與蛋白激酶的活性相互關(guān)聯(lián)，甚至是病毒DNA釋放的基礎(chǔ)。同時(shí)，PK-1是AcMNPV中一種極晚期基因轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的組分，因此，體外獲得PK-1蛋白對研究其功能有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)將AcMNPV pk-1基因進(jìn)行克隆，并在原核和真核系統(tǒng)中分別表達(dá)。根據(jù)GenBank中提交的AcMNPV pk-1基因序列利用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對中國科學(xué)院動(dòng)物所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈與的AcMNPV基因組D

3、NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長度為819bp的目的DNA片段pk-1。構(gòu)建原核表達(dá)和真核表達(dá)的重組質(zhì)粒pk-1/pGEX4T1、pk-1/pET30a、pk-1/pFast HF Tb，酶切和測序鑒定，結(jié)果表明，三個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pk-1/pGEX4T1、pk-1/pET30a轉(zhuǎn)化E.coli BL21，16℃IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)。將pk-1/pFast HF Tb在DH10Bac感受態(tài)中進(jìn)行轉(zhuǎn)座（同轉(zhuǎn)化過程），通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性克

4、隆，LB-TGK培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Sf9。利用Western blot對第一代病毒進(jìn)行檢測，確定PK-1蛋白在Sf9細(xì)胞中已表達(dá)。擴(kuò)培第二代病毒使PK-1進(jìn)行大量真核表達(dá)。利用親和層析技術(shù)對表達(dá)成功的PK-1蛋白進(jìn)行純化，所用特異結(jié)合材料為GSH、Ni柱子和Flag抗體。SDS-PAGE檢測表達(dá)和純化效果，結(jié)果表明，分別得到大小為58kDa、33kDa、34kDa的PK-1融合蛋白，其蛋白濃度分別為0.45mg/mL、0.68m