苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒38K蛋白的核定位信號(hào)研究.pdf

1、桿狀病毒可專性感染昆蟲，苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的代表種。38K基因是在所有已測序桿狀病毒基因組中均存在的31個(gè)核心基因之一。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，可表達(dá)AcMNPV38K—綠色熒光蛋白融合基因的重組病毒vAc38KGFP感染Sf9細(xì)胞24h后，融合蛋白開始入核，隨后幾乎所有的融合蛋白都集中在細(xì)胞核中，暗

2、示38K存在一段可以使融合蛋白趨向細(xì)胞核的氨基酸序列。核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)往往由4-8個(gè)連續(xù)堿性氯基酸組成，可使攜帶該段序列的蛋白定位于細(xì)胞核中。在本研究中我們對(duì)38K的NLS進(jìn)行了研究。 AcMNPV38K由320個(gè)氨基酸組成。根據(jù)36個(gè)稈狀病毒38K同源物的氨基酸序列比對(duì)分析，可將38K分為3個(gè)保守區(qū)段：即a(aa1-aa52)、b(aa53-aa213)、c(aa2

3、14-aa320)。分別將編碼a、b、c、ab、bc和全長38K的核莆酸序列與gfp基因融合，并克隆至瞬時(shí)表達(dá)載體pIZ/V5-His。將構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)：48 h后，含有c的融合蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而不含c的融合蛋白在細(xì)胞核中沒有分布。用構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞6h后，霉用AcMNPV感染細(xì)胞，融合蛋白分布結(jié)果與瞬時(shí)表達(dá)檢測結(jié)果相同。利用Bac—to—Bac外源基因表達(dá)系

4、統(tǒng)，將上述不同的核苷酸片段通過位點(diǎn)特異性重組轉(zhuǎn)座入AcMNPV bacmid中，構(gòu)建了可表達(dá)不同38K片段—GFP的重組病毒。重組病毒感染sf9細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：融合蛋白的分布與上述結(jié)果一致。以上研究表明38K的NLS可能位于c中。 將c中的部分堿性氨基酸分別點(diǎn)突變，即K251A、K254A、K269A、K289A、K228A/K229A/R230A、K258A/K263A、K291A/R292A共7個(gè)單獨(dú)或者連續(xù)

5、位點(diǎn)進(jìn)行突變。按照與感染相同的方法感染Sf9細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示：這些位點(diǎn)的突變并不顯著影響38K突變體—GFP融合蛋白的入核。進(jìn)一步的點(diǎn)突變位點(diǎn)的組合方式或者片段缺失將是繼續(xù)探索38K NLS的必要步驟。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)也可能暗示了：38K作為核衣殼裝配的重要基因之一，一旦它的功能不能正常行使，將影響到整個(gè)病毒的作用。因此，桿狀病毒在其長時(shí)間的進(jìn)化過程中配備了不止一套NLS。在NLS關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生突變后，有一套另外的NL