JC病毒VP2蛋白的抗原抗體制備及核定位信號(hào)與入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體的鑒定.pdf

1、目的： JC病毒屬于人類多瘤病毒屬，是一種重要的機(jī)會(huì)感染性疾病病原體。JC病毒廣泛分布于人群中，有80％的成人血清學(xué)檢測為陽性[1]。當(dāng)免疫力低下時(shí)，JC病毒會(huì)引發(fā)多灶性腦白質(zhì)病(PML)[2]。然而，JC病毒的臨床檢測，以及它的包膜蛋白VP2入核的機(jī)制和入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體并不清楚。本研究擬通過原核表達(dá)、抗體制備、核定位信號(hào)鑒定和入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體的鑒定幾個(gè)方面初步闡釋JC病毒的小包膜蛋白VP2基因在PM/L發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能。

2、 方法： (1) 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-VP2，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得了帶有組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)。 (2) 利用Ni+親和柱純化表達(dá)蛋白并免疫BALB/c小白鼠，獲得抗VP2多克隆抗體。以純化VP2為抗原，利用Western blot和ELISA法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行特異性和效價(jià)檢測。 (3) 構(gòu)建重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C1-VP2，轉(zhuǎn)染7402細(xì)胞，24

3、hr后觀察各截短體的亞細(xì)胞定位情況。 (4) 表達(dá)純化pGEX-2T-importin(importin α 1、3、5、7和imporinβ)的GST融合蛋白。 (5) 通過GST-pull down方法，尋找并確定VP2的入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體。 結(jié)果： (1)通過PCR方法從病人的腦脊液中獲得VP2的目的片段，并成功構(gòu)建了pET-32a(+)-VP2原核表達(dá)載體。pET-32a(+)-VP2原核表達(dá)載體在IP

4、TG的誘導(dǎo)作用下，成功表達(dá)融合蛋白通過Ni+親和層析法獲得了融合蛋白純品。 (2)用純化的VP2融合蛋白免疫BALB/c小鼠，成功制備了高效價(jià)，高特異性的鼠抗VP2多克隆抗體。通過ELISA法表明多克隆抗體效價(jià)>1：160，000，Western blot檢測證明多克隆抗體的特異性良好。 (3)通過PCR方法獲得了VP2截短體的目的片段，成功構(gòu)建了VP2各截短體的綠色熒光表達(dá)載體；將構(gòu)建好的VP2各截短體綠色熒光表達(dá)載體

5、轉(zhuǎn)染7402人肝癌細(xì)胞，通過各截短體的亞細(xì)胞定位分析出了VP2蛋白的核定位信號(hào)為946-972段。 (4)成功表達(dá)純化了五個(gè)pGEX-2Timportin融合蛋白。 (5)通過GST-pull down實(shí)驗(yàn)，分析發(fā)現(xiàn)VP2能夠與入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin α 1、importin α 3結(jié)合，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，發(fā)揮它的生理和生化作用。 結(jié)論： 1.我們成功構(gòu)建了pET-32a(+)-Vp2原核表達(dá)

6、載體，在IPTG的誘導(dǎo)下，成功表達(dá)純化了VP2融合蛋白。這就為抗體的制備以及研究VP2蛋白與其它蛋白的相互作用做了物質(zhì)上的準(zhǔn)備。 2.將VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，制備了高效價(jià)、高特異性的鼠抗VP2多克隆抗體。這對(duì)于VP2抗原的檢測，以及免疫組化奠定了基礎(chǔ)。 3.成功的鑒定出VP2的核定位信號(hào)，通過構(gòu)建四個(gè)pEGFP-C1-Vp2綠色熒光載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染7402細(xì)胞株，在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-C1-Vp2各截短