水貂腸炎病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及膠體金試紙條的研制.pdf

1、水貂病毒性腸炎（Mink viral enteritis）是由水貂腸炎病毒（Mink enteritis virus, MEV）引起的一種急性傳染病。自然條件下主要特性為劇烈腹瀉，幼齡水貂具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著世界毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)的快速發(fā)展，水貂病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病之一，給全世界養(yǎng)貂業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　免疫膠體金層析技術(shù)（Gold immunochromatography assay, GICA）

2、是免疫層析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)及免疫反應(yīng)的結(jié)合體。膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為標(biāo)志物應(yīng)用抗原、抗體檢測(cè)的一種新型的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單快速、結(jié)果清晰，可通過(guò)肉眼觀察、靈敏度高、無(wú)污染和攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。因此該技術(shù)得到了迅速發(fā)展，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也越來(lái)越多。
　　本研究采用競(jìng)爭(zhēng)法建立檢測(cè)MEV膠體金試紙條，檸檬酸三鈉還原法制備20 nm的膠體金顆粒與抗MEV單克隆抗體合成金標(biāo)探針。純化的MEV VP2蛋白包被在NC膜上作為檢

3、測(cè)線（T線），羊抗鼠IgG包被在NC膜上作為質(zhì)控線（C線），組裝成膠體金層析試紙條。
　　根據(jù)水貂腸炎病毒MEVB毒株，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增MEV VP2結(jié)構(gòu)蛋白基因獲得1773 bp基因片段；將該基因片段連接到克隆載體上，驗(yàn)證正確后定向連接到原核表達(dá)載體PET-30a，構(gòu)建MEV VP2基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒PET-30a-VP2。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21（DE3），重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)后

4、進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白在37?C，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1.0 mmol/L條件下良好表達(dá)，鑒定該重組MEV VP2蛋白以包涵體的形式存在，大小約為70 KD，用鎳柱純化后獲得較純的融合蛋白。
　　采用蔗糖密度梯度超速離心法純化MEVB細(xì)胞培養(yǎng)物。經(jīng)純化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠，制備脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA方法的篩選，獲得6株能穩(wěn)定分泌抗MEV

5、單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4、6、8、10、13、14。該6株單克隆抗體分別進(jìn)行了腹水效價(jià)測(cè)定，結(jié)果為單抗4和13抗體效價(jià)為1.28×105，單抗6和14抗體效價(jià)為2.56×105，單抗8和10抗體效價(jià)為5.12×105；特異性試驗(yàn)鑒定該6株單克隆抗體能與犬細(xì)小病毒（CPV）及水貂腸炎病毒（MEV）呈陽(yáng)性反應(yīng)，但不與犬瘟熱病毒（CDV）、水貂阿留申病毒（AMDV）及犬腺病毒（CAV）發(fā)生反應(yīng)；經(jīng)亞型鑒定，其中單抗4、10為Ig

6、G2b亞型、單抗6為IgG1亞型，單抗8、13、14為IgG2a亞型；間接免疫熒光鑒定該6株單克隆抗體均能使接毒的F81細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光；免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示該6株單克隆抗體可在約70 KD處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶。本試驗(yàn)為MEV的深入研究、快速診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　采用檸檬酸三鈉還原法制備出20 nm膠體金顆粒，與抗MEV單克隆抗體10偶聯(lián)形成金標(biāo)探針。優(yōu)化最佳試紙條各項(xiàng)參數(shù)，將MEV VP2蛋白以0.8 mg/mL的濃度

7、包被于NC膜上作為檢測(cè)線（T線），將羊抗鼠IgG以1 mg/mL濃度包被于NC膜上作為質(zhì)控線（C線）。該膠體金檢測(cè)試紙條的敏感性為1:64。該試紙條檢測(cè)MEV和CPV樣品為陽(yáng)性結(jié)果，而對(duì)CDV、CAV和AMDV等相關(guān)病毒樣品檢測(cè)均為陰性結(jié)果，說(shuō)明該試紙條特異性良好。與CPV膠體金試紙條方法符合率可達(dá)到94.1％。在4?C和25?C條件下可以保存6個(gè)月其敏感性和特異性沒(méi)有明顯的變化。本研究成功的建立檢測(cè)MEV膠體金試紙條，為早期診斷、預(yù)防