恩諾沙星單克隆抗體的制備鑒定及其膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、目的：制備抗恩諾沙星單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)免疫分析方法，同時(shí)研究開(kāi)發(fā)膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)恩諾沙星的殘留，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)恩諾沙星的殘留提供新的借鑒和方法。 方法：采用N-羥基琥珀酰亞胺法合成2種人工抗原，采用FeCl3顯色法、MALDI-TOF-MS法對(duì)人工抗原進(jìn)行鑒定同時(shí)測(cè)定偶聯(lián)比。將免疫抗原腹腔注射免疫BALBC/C鼠，采用雜交瘤技術(shù)篩選出特異性分泌抗恩諾沙星單克隆抗體的細(xì)胞株并獲取腹水。建立酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)恩

2、諾沙星的殘留，繪制恩諾沙星競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，確定其檢測(cè)限(LOD)、半數(shù)抑制率(IC50)及與其他抗菌藥物的交叉反應(yīng)率(CR％)，測(cè)定恩諾沙星在牛奶、雞蛋、血清中的回收率及變異系數(shù)(CV％)。同時(shí)，依據(jù)免疫層析技術(shù)研制恩諾沙星殘留檢測(cè)的膠體金免疫層析試紙條。 結(jié)果：(1)成功合成了2種恩諾沙星人工抗原Enro-BSA與Enro-OVA，F(xiàn)eCl3顯色法結(jié)果證明恩諾沙星與BSA及OVA的偶聯(lián)成功，MALDI-TOF-MS法測(cè)定Enro

3、-BSA的偶聯(lián)比為13：1。(2)采用雜交瘤技術(shù)篩選出2株特異性分泌抗恩諾沙星單克隆抗體的細(xì)胞株1A10和4B12并獲取腹水，純化后腹水效價(jià)為1：12800000。(3)繪制了恩諾沙星競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，單抗的最佳稀釋倍數(shù)為1：320000，檢測(cè)抗原Enro-OVA工作濃度為37.5ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.1～1000ng/ml之間線性關(guān)系良好(R2=0.9961)，LOD=0.1ng/ml，IC50=2.6ng/ml。交叉反應(yīng)結(jié)果表明，恩

4、諾沙星與環(huán)丙沙星、馬波沙星及氧氟沙星CR％為0.26％，與諾氟沙星、沙拉沙星、奧比沙星、二氟沙星、達(dá)氟沙星CR％小于0.01％，與不同族的氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、頭孢氨芐等沒(méi)有交叉反應(yīng)。(4)測(cè)定牛奶、雞蛋、血清中恩諾沙星的平均添加回收率分別為87.00～110.00％、60.00～77.69％、79.14％～87.00％，CV％分別為4.7～11．2％、7.9～16.9％、3.9～7.1％。(5)膠體金標(biāo)記恩諾沙星