磺胺甲噁唑單抗制備及膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、磺胺甲噁唑(SMZ)，在獸醫(yī)臨床上主要用于呼吸道和泌尿道感染的治療，具有抗菌譜廣、療效確切、性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便、價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。但不合理的用藥，可導(dǎo)致磺胺類藥物在可食用動(dòng)物組織中的殘留，對(duì)食品安全和人類健康造成危害。有必要建立一系列有效的方法，以滿足不同條件下動(dòng)物性食品中SMZ殘留的檢測。目前，SMZ殘留的檢測方法主要有，微生物法、色譜技術(shù)、免疫學(xué)分析法。為探索并建立一種能夠簡單、快速、適量檢測SMZ殘留的方法，本研究在利用雜交瘤技

2、術(shù)制備了靈敏度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高的單抗，在建立動(dòng)物性食品中SMZ殘留的ELISA測定方法基礎(chǔ)上研制了SMZ金標(biāo)檢測試紙條。
　　 1、SMZ全抗原的合成?；前芳讎f唑?qū)儆诎肟乖謩e用重氮法、戊二醛法和碳二亞胺法制備SMZ與牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和人血清白蛋白(HSA)的完全抗原，作為包被原和免疫原。完全抗原SMZ-BSA，SMZ-OVA和SMZ-HSA純化后通過紫外掃描進(jìn)行檢測，確認(rèn)SMZ已經(jīng)偶聯(lián)到蛋白上。

3、并計(jì)算出藥物SMZ和載體蛋白BSA、OVA和HSA分子結(jié)合比為23.3∶1、17.7∶1和24.5∶1。
　　 2、SMZ單抗的制備。用重氮法合成的完全抗原SMZ-BSA免疫7周齡BALB/C小鼠，利用單克隆抗體技術(shù)和現(xiàn)代細(xì)胞融合技術(shù)獲得一株可持續(xù)分泌針對(duì)藥物SMZ抗體的雜交瘤細(xì)胞株1C5，將細(xì)胞株1C5接種到小鼠體內(nèi)，采用誘生腹水法制備了抗SMZ的腹水，其蛋白濃度為24.9mg/mL，效價(jià)達(dá)1∶80000以上，SMZ藥物競爭抑

4、制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.3068x+0.0824(R2=0.9955)，IC50為22.9ng/mL，LOD為1.02ng/mL，LOQ為5.39ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)表明，SMZ抗體對(duì)磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMD)、磺胺噻唑(ST)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM')、磺胺醋酰(SA)等7種藥物均無交叉反應(yīng)。
　　 3、SMZ膠體金免疫層析試紙條研制。實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法制25nm膠體金，鑒定質(zhì)量后

5、，標(biāo)記單克隆抗體。將金標(biāo)抗體噴涂在Ahlstrom8964玻璃纖維素上，特異性抗原包被在Millipore135硝酸纖維素膜上，制成快速檢測試紙條。并對(duì)SMZ膠體金免疫層析試紙條的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，并確定了最佳條件，成功建立膠體金免疫層析檢測SMZ殘留的方法。使用試紙條對(duì)SMZ標(biāo)準(zhǔn)液檢測，檢測限為100ng/mL。交叉實(shí)驗(yàn)表明，試紙條對(duì)SQ、SD、SMD、ST、SDM'、SA等6種藥物均無交叉反應(yīng)。
　　 4、SMZ添加回收實(shí)驗(yàn)

6、。本研究對(duì)應(yīng)用磺胺甲噁唑較多的動(dòng)物性食品進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)。用ELISA方法測得在牛奶中藥物添加回收率為92.4％～112.6％，在雞蛋中的添加回收率分別為86.9％～128.2％，在雞肉中的添加回收率為68.4％～84.5％。并用試紙條檢測處理樣品進(jìn)行驗(yàn)證，雞肉樣品的檢測準(zhǔn)確率為91.7％，雞蛋樣品檢測準(zhǔn)確率為87.5％，雞肉樣品檢測準(zhǔn)確率為83.3％。結(jié)果表明試紙條能夠基本滿足檢測要求。
　　 本實(shí)驗(yàn)建立的對(duì)動(dòng)物性食品中磺胺