湖羊早期妊娠診斷免疫膠體金層析試紙條的初步研制.pdf

1、在妊娠早期，母畜外周血漿中的孕酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)情期，所以可以通過(guò)測(cè)定血液中的孕酮含量來(lái)進(jìn)行早期妊娠診斷。傳統(tǒng)的測(cè)定方法主要有放射免疫測(cè)定法（RIA），酶免疫測(cè)定法（EIA）和乳膠凝集測(cè)定試驗(yàn)（LAIT），但是由于操作比較復(fù)雜，所以并未得到廣泛的應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)是2世紀(jì)90年代在免疫滲濾技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免疫檢測(cè)技術(shù)，其檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼即可判斷。這種技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品安全和激素的檢

2、測(cè)。
　　 本試驗(yàn)采用膠體金免疫層析技術(shù)，根據(jù)試驗(yàn)確立的湖羊妊娠孕酮臨界值，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法研制出一種膠體金免疫層析試紙條；通過(guò)對(duì)配種后21 d左右湖羊血液中的孕酮進(jìn)行半定量測(cè)定，進(jìn)行早期妊娠診斷，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)的主要內(nèi)容包括以下3個(gè)部分：
　　 1.對(duì)85頭配種后21 d左右未出現(xiàn)返情的湖羊采用放射免疫測(cè)定法（RIA）測(cè)定其外周血中的孕酮含量。研究結(jié)果表明，妊娠羊的孕酮含量為2.33±0.70ng/mL，未妊娠羊的

3、孕酮含量為1.24±0.33ng/mL，懷孕羊的孕酮水平高于未懷孕羊，且差異顯著（P<0.05）。設(shè)定孕酮含量大于1.7ng/mL為妊娠，低于1.5n咖L為未妊娠，介于兩者之間為疑似懷孕。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，妊娠確診率為100％，未妊娠確診率為82.61％，疑似妊娠確診率為64％。
　　 2.為了獲得高質(zhì)量的金標(biāo)孕酮單抗，通過(guò)采用檸檬酸三鈉還原法制備出符合要求的30 nm的膠體金溶液，在此基礎(chǔ)上摸索膠體金標(biāo)記孕酮單克隆抗體的最佳條件，

4、并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量鑒定。用檸檬酸三鈉還原法制備的30 nm膠體金溶液呈深紅色，透射電鏡觀察，膠體金顆粒大小基本一致；膠體金標(biāo)記孕酮單克隆抗體的最低穩(wěn)定濃度為16μg/mL，最適穩(wěn)定濃度為19.2μg/mL，最適標(biāo)記pH為8.5。經(jīng)電鏡觀察，制備的金標(biāo)抗體復(fù)合物周圍有一層明顯的低電子密度暈圈，且其在520 nm處的OD值在0.2～0.4范圍內(nèi)。
　　 3.利用膠體金免疫層析技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)法原理，根據(jù)試驗(yàn)所得的湖羊早孕診斷血液孕酮臨界值，用金

5、標(biāo)孕酮單抗復(fù)合物為探針制成金標(biāo)墊，同時(shí)用11α-羥孕酮琥珀酸酯與BSA的偶聯(lián)物和羊抗小鼠IgG二抗包被硝酸纖維素膜分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備了半定量檢測(cè)孕酮的膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果采用國(guó)產(chǎn)SB-08玻璃纖維膜作為樣品墊材料，進(jìn)口Ahlstrom8964玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊，Millipore135硝酸纖維素（NC）膜作為層析材料制成試紙條。檢測(cè)線和質(zhì)控線上的包被濃度分別為1.6mg/mL和1.2mg/mL，金標(biāo)孕酮單抗按1:2稀釋