細(xì)粒棘球蚴膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制與初步應(yīng)用.pdf

1、細(xì)粒棘球蚴病，或稱囊型包蟲(chóng)病，是由細(xì)粒棘球蚴（Echinococcus granulosusis）所引起的一種人畜共患性寄生蟲(chóng)病。在我國(guó)感染細(xì)粒棘球蚴的動(dòng)物當(dāng)中，羊的感染情況最嚴(yán)重。但臨床應(yīng)用中，對(duì)細(xì)粒棘球蚴病的不同診斷方法，依然存在各自的缺陷。因此，本研究的目的在于建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的利于基層診斷的羊細(xì)粒棘球蚴檢測(cè)方法。
　　本研究對(duì)細(xì)粒棘球蚴HSP70(Heat shock protein70)蛋白進(jìn)行了克隆及原核表達(dá)，

2、根據(jù)GenBank中的細(xì)粒棘球蚴hsp70基因序列，用Primer5軟件設(shè)計(jì)了特異性引物，以細(xì)粒棘球蚴基因組為模板，擴(kuò)增hsp70片段，將該基因片段克隆至pMD18-T Vector并至感受態(tài)大腸桿菌TOP10，再用PCR及酶切鑒定。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，得到了大小為957bp的目的片段，與GenBank中的序列相比，兩者相似性為99.4％。然后將該片段和表達(dá)載體pET30a分別用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，構(gòu)建了表達(dá)載體pET30a

3、-hsp70，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析顯示，細(xì)粒棘球蚴HSP70的原核表達(dá)成功，蛋白約為43 kDa。接著用純化蛋白免疫新西蘭雄性白兔，第二、第三次免疫后一周采血、析出血清，并進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，判斷免疫效果;第四次免疫后一周大量采血、析出血清，進(jìn)行抗體效價(jià)及特異性檢測(cè)，最終獲得效價(jià)為＞1∶51200的多抗。同時(shí)，本研究制備了直徑約為15nm的膠體金顆粒，以膠體金標(biāo)記HSP70，制備

4、膠體金試紙條，建立了一種細(xì)粒棘球蚴的快速檢測(cè)方法。該方法可在20 min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，400～500倍稀釋待檢血清得到的顯色條帶最明顯，并且在陽(yáng)性羊血清稀釋到1000倍依舊可以觀察到陽(yáng)性條帶，與感染肝片吸蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、小反芻獸疫、口蹄疫的羊陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，且試紙條在4℃保存8個(gè)月后依然具有較高的檢測(cè)效果。本研究中采集了來(lái)自浙江省杭州、溫州、麗水、舟山、臺(tái)州、衢州、金華、湖州、嘉興、紹興、寧波11個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的728份羊血清

5、樣品，并應(yīng)用建立的膠體金免疫層析檢測(cè)方法對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品中呈陽(yáng)性的有19份，浙江省這11個(gè)地區(qū)的總檢測(cè)陽(yáng)性率為2.61％。對(duì)羊血清樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示浙江省部分地區(qū)羊的細(xì)粒棘球蚴感染明顯少于西北地區(qū)，提示在浙江省地區(qū)對(duì)該病的防治工作做得相對(duì)較好。
　　綜上所述，本研究基于細(xì)粒棘球蚴hsp70基因建立了一種可靠的膠體金試紙條檢測(cè)方法，運(yùn)用該方法對(duì)浙江省11個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)