多肽抗原的設計與抗體制備

1、多肽抗原的設計與抗體制備,,,多肽抗原的設計多肽的固相合成和純化多肽的交聯(lián)和免疫抗多肽抗體的檢測和功能學鑒定抗體的純化怎樣利用Internet 的免費資源尋找與抗體相關的信息,,,,抗合成肽類抗體制備程序,免疫原性肽的選擇,,肽的合成、純化與鑒定,,載體蛋白的選擇,連接劑的選擇,,,,,,載體蛋白/肽連接物,,免疫動物,,McAb的制備,,ELISA篩選抗體血清反應性,,收集陽性血清,,Western blot, Immuno

2、fluorescence assay 鑒定抗體的生物學功能,,陽性抗體的純化,抗體制備常用的免疫原,1：表達純化一段或全長的重組的帶GST,Histag的融合蛋白 Abnova corporation 2：利用合成肽制備抗體 AVIVA SYSTEMS BIOLOGY LIFESPAN BIOSCIENCES 3：利用純化的天然蛋白,免疫原性肽選擇的基本程序,,利用在線設計軟件或DNAStar篩選抗

3、原性強的多肽序列,,盡量使用N端或C端的序列,,該序列經(jīng)Blast后在人的其他蛋白中同源性要低，最好在小鼠或大鼠中高度保守,,用peptide companion 軟件判定易于合成的14-16個氨基酸,免疫原性肽選擇的注意事項,避開信號肽，磷酸化，糖基化位點避開很多蛋白所共有的相同的或相近的motif,例如zinc finger，SH2 domains ，GTP binding sites 。有些蛋白在成熟的過程中會切割掉一小段

4、肽段。如果選用MBS交聯(lián)方法，需要在N端或C端加上C對于有些基因來說，可能含有不止一個轉錄異構體（transcript variants ），這時就要在這些轉錄異構體的共有序列中尋找抗原多肽,利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫輔助設計,..\UniProtKB-Swiss-Prot entry P26992 [CNTFR_HUMAN] Ciliary neurotrophic factor receptor alpha.htm,,,

5、,,,,,,,,多肽的固相合成,此法的基本過程是：基于Fmoc化學合成，將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子保護性氨基酸的羧基（已經(jīng)活化）作用（用NMM,HBTU作偶聯(lián)劑）形成肽鍵。不斷重復這一過程，即可以得到目標多肽產(chǎn)物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產(chǎn)物。,,,合成原料,Fmoc-AA(prot)-Wang resin 提供肽鏈

6、延伸反應的固相顆粒狀介質 例如：Fmoc-His(Trt)-Wang resin Prot：Boc,tBu,Trt,OtBu 側鏈活性位點的保護基團 Fmoc: α-NH2保護基團： Boc: Trt:,,Fmoc-AA(Prot)-OHSolvent 1: DMFSolvent 2: 20%pipdine/DMFSolvent

7、3: 0.4M NMM/ HBTU/DMFSolvent 4: 50% ACN/DMFSolvent 5: methylene chlorideSolvent 6: 94% TFA/2.5%EDT/1%Anisol/2.5%H2O,標準合成程序,Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 D

8、MF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6

9、 4 Reagent(AA) 1 00:00:00 off 1 5 0.4M NMM/HBTU/DMF 1 00:40:00 on 1 6 DMF 1 00:00:

10、30 on 3,標準切割程序,Step solvent/operation volume mix time drain Rep 1 DMF 1 00:00:30 on 3 2 20%pipdine/DMF 1

11、 00:07:00 on 2 3 DMF 1 00:00:30 on 6 4 methylene chloride 1 00:00:30 on 6 5

12、 Dry 1 00:10:00 on 1 6 TFA 2 02:00:00 on 1 7 TFA 1 00:00:30

13、 on 1 8 methylene chloride 1 00:00:30 on 3 9 Dry 1 00:02:00 on 1,,多肽合成的一般常識,固相多肽合成一般最多只能合成到20aa。為了保證合成的效率

14、和純度，我們在設計多肽抗原時，一般設計14-16aa的多肽。減少多肽序列中多個困難性氨基酸Cys, Met, Arg, or Trp的含量。避免多肽序列中連續(xù)3到4個疏水性的氨基酸。（Val-V，Leu-L，Ile-I，Met-M，Phe-F）避免Asp-Pro序列避免多肽序列中最后一個氨基酸是Pro。PIWIL3 SR0015 FFLKHGSNFQNPPPCaspase 2 SR0024 TDTVEHSLDNK

15、DGPCaspase 7 SR0032 DRVARHFESQSDDP切割完以后，用乙醚沉淀什么都沒有,,多肽兩端的氨基酸對多肽溶解性的影響要遠大于其中間序列，因此要避免其兩端有連續(xù)的兩個疏水性氨基酸。 Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 極難溶 DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇 可以用

16、peptide companion 軟件輔助判定多肽合成的難易程度，但是由于該軟件默認了最后四個氨基酸是容易合成的，可是有時實際情況并不如此，因此依然需要綜合考慮,TIE1 SR00043 DRPEETSTIIRGLN,,BAG4： SR00079 LRRSGYGPSDGPSY,,SR00007 Dicer GKVRVTVEVVGKGK,,多肽的鑒定和純化,合成完整長度粗肽的純度不僅取決于多肽的本身長度和序列的特異性，還和使用的各種試劑

17、的質量密切相關，因此我們合成多肽使用的試劑都是色譜純。Fmoc固相多肽合成每個氨基酸的偶連效率在95%以上。對于一個15aa的粗肽，其完整長度多肽的合成效率一般在50%左右。,質譜分析（MS/ESI）,用途：測定合成的粗肽產(chǎn)物中目標肽的分子量，以此來衡量我們合成的肽序列是否正確原理：將樣品分子離子化后，根據(jù)離子間不同的質荷比（m/z）來分離并確定分子量。,TPTE SR00283: (CH3CO)RVSENKRRYTRDGFC M

18、W：1887.13+42=1929.13,,TNFRSF13B SR00306 （NH2）PELRRQRSGEVENNSD MW：1885.99,,,多肽粗品中一般含有非全長多肽,非多肽類雜質。非多肽類雜質主要是指去保護過程中產(chǎn)生的一些保護性基團，多肽裂解過程中的一些原料如DTT、TFA等。粗肽的一般后期純化處理有脫鹽，離子交換色譜，反相HPLC。國內(nèi)外的多肽公司可以根據(jù)用戶要求的純度選擇不同的純化方法。多肽的純度分析一般使用反相

19、HPLC，通常都能得到較好的分析效果。,多肽脫鹽（凝膠過濾法）,原理：利用凝膠層析介質(固定相)交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質的分子量大小差異而進行分離的一種方法。,,表 葡聚糖凝膠(Sephadex )的物理特性,多肽脫鹽條件選擇,Sephdex G-15: 適用于分子量在1500-2000多肽的脫鹽，對于分子量超過1500的多肽能夠完全排阻。柱子的選擇：鼎國自產(chǎn)10

20、mm×20cm色譜柱柱床體積：根據(jù)上樣體積確定，一般柱床的體積不要少于上樣體積的10%。我們一般脫鹽1.0ml的多肽，柱床體積通常選者10-15ml。洗脫速度：洗脫速度會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。流速通常選擇 1ml/min洗脫夜: PBS， 0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 檢測波長：214nm,

21、SR0002脫鹽結果,稱取SR0002約7.0mg,溶于1.0ml的0.1M NaHCO3-0.5M NaCl(PH8.3) 過柱收集：500ul/管OD214(空白）=0.664 (1) OD214 =0.704 (7) OD214 =0.869(2) OD214 =0.713 (8) OD214 =1.095(3) OD214 =0.710 (9)

22、 OD214 =0.909(4) OD214 =0.718 (10) OD214 =0.780(5) OD214 =0.724 (11) OD214 =0.661(6) OD214 =0.742 (12) OD214 =0.598,峰形區(qū)帶變寬，收集第（6），（7），（8），（9），（10）管共約2.5ml，會有部分損失。,多肽RL-HPLC分析,RL-HPLC是一種分辨

23、率最高的分離分析方法，可以分開長度上相差一個氨基酸的多肽。流動相中溶質分子與固定相配基間的疏水性相互作用形成的“on-off”機制。RL-HPLC分離多肽的基礎是待分離多肽間“疏水腳”的細微差別，這些差別來源于氨基酸序列和構象的差異。,SR0001多肽的RL-HPLC分析,色譜柱：瑞典進口填料Kroamsil C18柱 250*4.6mm,5um,120A(<2,000MW) 分析

24、程序： 洗脫液A(弱移動相）:500ml 0.1%TFA in H2O 洗脫液B(強移動相）:500ml 0.09%TFA in 60%acetonitrile/40% H2O （V/V) 樣品溶解：0.25mg SR0001溶于80ul A液中，加入不超過總體積25%的B液（即20ul)助溶。取80ul加入4ml的水稀釋，上樣20ul/1ug。,,Linear A B gradientEluent A:

25、 0.1%TFA in H2O Eluent B: 0.09%TFA in 80%acetonitrile/40% H2O （V/V) Gradient range and time: 95%-0% A in 90 mins 5%-100% B in 90 mins Flow rate:0.8-1.0ml/mins Gradient rate:1% B/mins Det

26、ection: 214nm Temperature: 25℃,,,,SR00001 RL-HPLC分析結果,,如果我們獨立的看這一張色譜峰形圖，我們并不能確定這個主峰就是代表合成的完整的多肽，需要聯(lián)合進行質譜分析其分子量，從而最終確定該峰是否代表合成的完整的多肽。 對于合成的18個aa以下的多肽，通過RL-HPLC分析通常都能得到單一的主峰。因為在我們的合成程序中并沒有引入別的反應程序，而且每步反應的效率都在95%以上

27、，因此根據(jù)經(jīng)驗我們就可以認為該主峰就是代表我們合成的完整多肽。 根據(jù)實驗目的來確定多肽是否需要純化或者純化到什么級別，免疫級別的多肽一般純度達到70%就可以了。,多肽的溶解和保存,多數(shù)肽易溶于無菌的PBS對于堿性肽來說（K,R,H),如果一開始用PBS不溶解，用10%或更高濃度的乙酸溶解。如果肽仍然不溶解，加入<1/20體積的TFA溶解對于酸性肽來說（D,E),如果一開始用PBS不溶解，加入<1/20體積的稀氨

28、水溶解對于極疏水的肽用10%的乙腈或甲醇溶解仍然不溶的極個別肽試著用DMF，鹽酸胍來溶解。但是我們一般還是首選甲醇而要避開乙腈（CH3-C DMF（,-,,-,-,N),,CH3,,CH3,,,N,,C,//,O,,H,）,,小技巧：多肽的溶解具有“全或無”的特性，當發(fā)現(xiàn)某個多肽兩端有連續(xù)兩到三個疏水性氨基酸時，這樣的多肽可能就是不好溶的，我們可以先稱1-2mg的多肽試溶于PBS，如果比較好溶的話，那么7

29、-8個mg的多肽溶解也不成問題。如果不溶于PBS的話，就稱取1-2mg的多肽試溶于有機溶劑。這樣做的目的就是不要浪費多肽。,多肽的保存,所有多肽均以粉末狀保存于-40度，在這一條件下，多數(shù)肽可以保存幾年。禁止將合成的肽都溶解以后分裝保存，提倡用多少取多少。溶液肽遠比凍干形式不穩(wěn)定，溶液應為中性pH(pH5-7), -20℃保存的，為避免樣品的反復凍融， 最好分成小樣存放。一份樣品融凍后未用完， 應扔掉。,多肽偶聯(lián),合成的多肽分子量較

30、小，免疫原性較差。故常需與載體蛋白交聯(lián)以增強其免疫原性 。偶聯(lián)是一種基于化學偶聯(lián)劑的化學反應，大多數(shù)依賴于游離的氨基，巰基，酚基，羧基的存在。游離氨基：多肽N端的第一個氨基酸（α-NH2)，K游離巰基: C游離酚基：Y游離羧基：多肽C端的第一個氨基酸（α-COOH), D, E,載體蛋白選擇,KLH： MW >2000KD 6.9ε-NH2，1.7-SH， 7.0 酚基,BSA: MW

31、 67KD 59 ε-NH2，1-SH， 19酚基 OVA: MW 43KD 20 ε-NH2，4-SH， 10酚基 肌紅蛋白： MW 17KD 19 ε-NH2， 0-SH， 3酚基 絕大多數(shù)國外的抗體公司用KLH作為載體蛋白。,交聯(lián)方法,MBS法戊二醛法EDC法,,,MBS Coupling,,,EDC method,,以上的四種交聯(lián)方法中，最

32、常用的還是前三種，但是戊二醛法，EDC法，都有一定程度的二次反應。,,偶聯(lián)劑,修飾的氨基酸,,初次反應,二次反應,,MBS,Cys-SH,,戊二醛,Ε-NH2Lys，α-NH2，SH-Cys,Tyr，His,EDC,Ε-NH2Lys，α-NH2， α-COOH，Glu，Asp,Tyr，Cys,,,不同的肽序列應該選擇不同的偶聯(lián)方法。偶聯(lián)是一定要發(fā)生在多肽的末端，避免偶聯(lián)發(fā)生在多肽的中間序列。N-端序列需要通過C-端氨基酸偶聯(lián)，而C-端

33、序列則需要通過N-端氨基酸偶聯(lián)。 CLIC1（241aa) SR00239 (147-160aa) : PLPEEVDETSAEDE,,（NH）,,B S A,,（NH）PLPEEVDETSAEDE,K,K,(NH),,（NH）PLPEEVDETSAEDE,(NH),,（NH）PLPEEVDETSAEDE,K,(NH),,（NH）PLPEEVDETSAEDE,K,(NH),（NH）PLPEEVDETSAEDE,,典型的錯誤偶聯(lián)方式,,

34、CLIC1（241aa) SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKL,B S A,K(NH),,VDTKRRTETVQKL,(HN）,K(NH),,(HN),VDTKRRTETVQKL,K(NH）,,（HN）,VDTKRRTETVQKL,K（NH）,,,(HN),VDTKRRTETVQKL,賴氨酸(K）含有游離的ε-氨基，他也可以通過戊二醛與載體分子上的氨基以共價鍵結合，可能會影響多肽鏈上賴氨酸及其附近氨基酸殘基暴露的

35、側鏈的免疫原性 或者產(chǎn)生的抗體不是針對天然蛋白中的多肽的確切結構 。,K(NH),,(HN),正確的偶聯(lián)方式在其C端加上一個C，用MBS法,CLIC1（241aa) SR00240（46-59aa):VDTKRRTETVQKLC,,B S A,K（NH）,,(HS),VDTKRRTETVQKLC,K（NH）,,(HS),VDTKRRTETVQKLC,K（NH）,,VDTKRRTETVQKLC（SH),K(NH),,VDTKRRTETVQ

36、KLC(SH),K(NH),,VDTKRRTETVQKLC(SH),,來源于蛋白中間序列多肽的偶聯(lián)可以發(fā)生在N端，也可以發(fā)生在C端，但是我們一般會選擇偶聯(lián)在免疫原性相對較弱的一端。有的公司提到：來源于蛋白中間序列的多肽，為了最大程度的模擬其在天然蛋白中的位置，其N端常乙酰化，C端酰氨化。有的公司則認為沒有必要，而且這樣做常常會增加多肽的疏水性，導致溶解度減小。,Conjugation Chemistry Determination F

37、low Diagram,no,yes,C-terminal conjugation,,Is there a C in sequence,no,yes,no,yes,yes,no,yes,no,made by puyong 2006.5.27,肽與載體蛋白偶聯(lián)結果觀察,連接物中多肽與載體蛋白的分子比影響其誘導免疫應答的效應。分子比太低，常常引起無關的免疫應答；分子比過高，易誘導低特異性抗體的產(chǎn)生。最適合分子比為：一個

38、BSA分子與5-15個半抗原分子結合。我們交聯(lián)后的肽-載體蛋白復合物，理論上平均一個BSA分子上面交聯(lián)了20個多肽分子。肽與載體蛋白的偶聯(lián)反應是一種比較穩(wěn)定和充分的化學反應，戊二醛的偶聯(lián)效率通常能達到80%以上，MBS的偶聯(lián)效率通常能達到90%以上。因此，很多公司認為沒有必要進行這一步的檢測。我們對偶聯(lián)結果通過SDS-PAGE做了定性檢測。,偶聯(lián)結果：SDS-PAGE膠考馬斯亮藍染色,,MBS偶聯(lián),,,,多肽免疫,免疫動物：健康新西

39、蘭大白兔1只飼養(yǎng)條件： 溫度：15-25℃ 飲食：100g 兔飼料/天，并配以白菜胡蘿卜少許 衛(wèi)生：專人每天負責清洗糞便托盤，拖洗地面，定期消毒。免疫方案：,,500ug多肽/1ml+1ml 完全佐劑混勻,皮下注射4-5點,,間隔一周,500ug多肽/1ml+1ml不完全佐劑混勻，皮下注射4-5點,,共加強3次,第七周取血ELISA檢測、收集血清。,,,,,,,,,多肽免疫注意事項,佐劑與抗原一定要充分混勻，

40、以混勻后靜置長時間不分層作為混勻充分的標準。每種抗原大概1.5ml,一般皮下免疫四到五點，每點大約0.25m，每點間隔大概1-2cm.不能為了圖省事，就直接免疫一到兩點，這樣抗原的吸收會不好。每次免疫要新選擇兔子背部上未免疫區(qū)域，因為免疫過的區(qū)域皮膚有時會結痂變硬。免疫過程中盡量避免扎到血管，引起出血和感染。,兔子取血和血清保存,頸動脈取血，每只兔子大概能收集35ml左右的血清。分裝2.5ml（0.5ml血清+0.5ml甘油）其余

41、的血清凍于-28℃ ，禁止凍融。血清一般不建議加疊氮鈉，因為疊氮鈉上的氨基基團會干擾偶聯(lián)反應和許多標記反應。而且我們?nèi)⊙钠餍担?0ml離心管都是經(jīng)過高壓滅菌的。,抗多肽抗體的檢測和功能學鑒定,肽封閉實驗確定抗體的特異性 Western 實驗中經(jīng)常能見到一條或超過一條帶，為了確定哪一條帶是特異性的針對抗多肽的抗體。 例如：Fas:（335aa) SR0065 (42-55aa) TTVETQNL

42、EGLHHD 戊二醛 交聯(lián),實驗步驟,1：確定Western 實驗所用抗體的效價和血清量 通常我們一條膜需要用 5ml blot buffer,按 1:50稀釋血清,需要100ul 血清。 2：封閉所用的抗原肽一般為血清量的5到50倍。也就是說如果1ug的血清，需要5到50ug的多肽。 來源于兔血清總抗體濃度為10ug/ul,特異性抗體的濃度一般為總抗體的10%，也就是1ug/ul。100ul的血清需要

43、封閉的肽量為1mg。 3：稱取1mg肽溶于900ul PBS中，加入100ul血清，37℃翻轉2小時，4 ℃翻轉5小時。同時做一不加多肽的對照。 4：4 ℃，12000rpm,15mins.小心的吸取上清作為一抗加入到反應盒中,結果觀察,陽性結果,Fas SR0065,陰性結果,TOP2A SR0065,抗體純化,DEAE-纖維素Protein A多肽抗原柱親和純化,親和純化,,,,,NH-PEPTIDE,NH-P

44、EPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,,,,,,,,,,,NH2-Tris,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH2-Tris,,,NH2-Tr

45、is,NH2-Tris,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,NH-PEPTIDE,,NH-PEPTIDE,NH2-Tris,NH2-Tris,+,交聯(lián),封閉,結合,洗脫,Made by puyong 2006.6.4,多肽抗體的純化結果,SIP1（HA）YPYDVPDYA,純化前19/10/05 2mins,純化后11/12/05 曝光過夜,純化抗體考馬斯亮藍染色結果,,甘氨酸洗

46、脫（1)高值,甘氨酸洗脫（1)低值,三乙胺洗脫（1）高值,三乙胺洗脫（1）低值,protein marker,BSA 4ug,甘氨酸洗脫(2)高值,甘氨酸洗脫(2)低值,三乙胺洗脫（2）高值,三乙胺洗脫（2）低值,甘氨酸洗脫（3)高值,甘氨酸洗脫（3)低值,三乙胺洗脫（3）低值,三乙胺洗脫（1）高值,注：每種洗脫的抗體均上樣10ul,,SR0002 Drosha GAAMDALEKYNFPQ,純化前19/10/05 2mins,將S

47、ROOO2甘洗脫(1)高值5.5ml，甘洗脫(2)高值3.2ml,甘洗脫(2)低值8ml，甘洗脫(3)高值2.7ml,甘洗脫(3)低值2.7ml,三乙胺洗脫（3）高值3.3ml收集在一起共25ml，加入NaN3至終濃度0.05%，BSA至終濃度0.5%?；旌虾蟮目贵w再次進行Western 檢測，結果見下圖：,未純化血清,混合后的抗體1:100,混合后的抗體1:50,混合后的抗體1:25,混合后的抗體1:250,16/12/05

48、30mins,,16/12/05 30mins,純化抗體考馬斯亮藍染色結果,,2ugBSA,4ugBSA,Protein marker,甘氨酸洗脫（1)高值,甘氨酸洗脫（1)低值,甘氨酸洗脫（2)高值,甘氨酸洗脫（2)低值,甘氨酸洗脫（3)高值,甘氨酸洗脫（3)低值,三乙胺洗脫（3）高值,三乙胺洗脫（3）低值,8/12/05,注：每種洗脫的抗體均上樣10ul,將不同次純化的抗體混合后考馬斯亮藍染色結果,,Protein marker,0

49、.5ug人IgG,1ug人IgG,2ug人IgG,4ug人IgG,10ul的混合抗體,SR0002 Drosha 10ul的混合抗體估計在0.75ug左右，那么25ml的混合抗體總量估計在2mg左右。,17/12/05,SR0004 DGCR8 LHILSKLQEEMKRL,陰性血清1:100,SR0004-1 1:100,SR0004-1 1:100,SR0004-2 1:100,SR0004-2 1:100,凍融至少4次的Hela,

50、新裂解的Hela,新裂解的Hela,凍融至少4次的Hela,未純化血清1:100,甘氨酸洗脫（1) 1:50,甘氨酸洗脫（2）1:50,三乙胺洗脫（1）1:50,純化前 7/11/05 曝光過夜,純化后 29/11/05 曝光過夜,SR0004 小量純化抗體考馬斯亮藍染色結果,,Protein marker,2ug人IgG,,12ul甘氨酸洗脫（1),12ul甘氨酸洗脫（2),12ul三乙胺洗脫（1）,14/12/05,抗體失去活性？,

51、SIP0002 (C-myc) EQKLISEEDL,商品化C-myc 1:1000,未純化血清 1:200,甘氨酸洗脫1:50,三乙胺洗脫1:50,27/11/05 曝光過夜,商品化c-myc 1:1000,未純化血清T-04 1:200,血清結合后 1:20,甘氨酸洗脫高值 1:20,16/12/05 30mins,注：上樣轉染含c-myc tag TTIF/PGBSK重組質粒的酵母裂解液,SIP0002 C-myc小量純化的抗體考

52、馬斯亮藍染色結果,Protein marker,2ug 人IgG,甘氨酸洗脫（1）12ul,三乙胺洗脫（1）12ul,三乙胺洗脫（2）12ul,14/12/05,尋找原因,血清中的抗體沒有結合到C-myc交聯(lián)的CNBr活化的Sephrose 4B上?,,C-myc多肽交聯(lián)？,,多肽脫鹽？,,6mg SIP0002脫鹽結果OD214(空白）=0.122(1) OD214 =0.122 (7) OD214 =0.34

53、4(2) OD214 =0.135 (8) OD214 =0.308(3) OD214 =0.185 (9) OD214 =0.227(4) OD214 =0.171 (10) OD214 =0.186(5) OD214 =0.139 (11) OD214 =0.159(6) OD214 =0.229 (12) OD214 =0.13

54、8(13) OD214 =0.135 (14) OD214 =0.137收集第（6）-（11）管,,交聯(lián)方法？,,EQKLISEEDL,,,EQKLISEEDL,利用Internet 免費資源尋找與抗體相關的信息,針對某種蛋白的多肽抗體，國外是否將已知多肽序列公布。 TNFRSF6B/ DcR3 SR00315(31-46): abcam公司：AETPTYPWRDAETGEC,,,ESR1 (595

55、aa)SR00341(247-260aa)EVGMKGGIRKDRRGC 可以用來制備單抗,,抗體的功能學驗證(WB,IHC-P,ICC) 用的是哪些細胞或組 織作為陽性對照,,大多數(shù)蛋白的預測分子 量與Western曝光后顯示 的分子量相一致，但也 有些蛋白的預測分子量 與Western曝光后顯示的 有差異，甚至差異很大。 例如CD40:,TOP2A,可能的