eRF3b羧基端部分多肽片段的分子克隆、表達及抗體制備.pdf

1、目的：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種在世界范圍內(nèi)廣為流行的一種疾病，是已知各型肝炎中危害最嚴(yán)重的一種。我國是世界肝炎大國，大約有7億人感染過乙肝，即總感染率為57％;有2300萬慢性肝炎患者，9300萬乙肝病毒攜帶者；每年因肝炎死亡的人數(shù)約有23萬人[1]。鑒于上述原因，我國在乙肝的預(yù)防和治療上也花費了很多費用，有報導(dǎo)可見每年防治乙肝的經(jīng)費約500億人民幣[2，3]。盡管對于乙肝的研究很多，但是乙肝迄今為止也沒有很好

2、的治愈方法，所以乙肝對全國人民的健康水平和國家財政收入都造成了很大的威脅。因此，臨床上迫切需要研究新的靈敏度和特異度都較高的診斷方法，并且發(fā)現(xiàn)新的有價值的生物標(biāo)志物，爭取做到早預(yù)防、早診斷、早治療，改善病人情況。
　　 研究乙型病毒性肝炎機制及其制備eRF3b羧基端部分多肽片段多克隆抗體，具有重大意義。本室前期利用MALDI-TOFMS技術(shù)發(fā)現(xiàn)4210Da蛋白為“GSPT2，真核肽鏈釋放因子GTP結(jié)合亞單位(eRF)”，也就是e

3、RF3b裂解后的一部分-37肽。GSPT2編碼eRF3b，具有參與蛋白合成中止的功能。eRF3b在肝臟感染乙肝病毒后的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了極其重要的作用，4210Da多肽作為其中一部分肽段而不斷出現(xiàn)在血液中，而且表達量在不同肝病組中差異明顯，提示該蛋白可以作為急性乙肝（AHB）轉(zhuǎn)為慢性乙肝（CHB）以及從慢性乙肝（CHB）患者中篩檢肝癌(HCC)患者的生物學(xué)標(biāo)志物。由于本研究是針對GSPT2氨基端第1421-1531位堿基進行的研究，其

4、間含有111個堿基，因此稱其基因為GSPT2-111，其對應(yīng)的蛋白稱為eRF3b-37。本研究的目的是制備融合蛋白GST-eRF3b-37兔多克隆抗體和GST-eRF3b-37大鼠多克隆抗體，為今后研究乙肝標(biāo)志物提供了依據(jù)，同時為乙肝分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)GSPT2-111的分子克隆。采用胍鹽酸法[14]從外周血中提取人基因組DNA，運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增獲得大量GSPT2-1

5、11基因片段。將GSPT2-111基因片段通過BamHI和EcoRI兩個酶切位點連接至pGEX-4T-1(GST)這一表達載體上，并應(yīng)用堿裂解法[14]提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切后進行質(zhì)粒PCR鑒定及測序分析。
　　 (2)融合蛋白GST-eRF3b-37的表達及可溶性鑒定。將GSPT2-111基因片段克隆到pGEX-4T-1(GST)這一表達載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后，經(jīng)1.0mMIPTG誘導(dǎo)后獲得帶有GST

6、標(biāo)簽的GST-eRF3b-37融合蛋白，通過10％SDS-PAGE電泳，檢測融合蛋白表達及可溶性。
　　 (3)融合蛋白GST-eRF3b-37的純化。大量表達GST-eRF3b-37融合蛋白，通過GST SefinoseTM Resin純化帶有GST標(biāo)簽的GST-eRF3b-37融合蛋白，然后進行10％SDS-PAGE電泳，檢測GST-eRF3b-37融合蛋白純化情況。
　　 (4)多克隆抗體的制備。用融合蛋白GST-

7、eRF3b-37作為抗原對新西蘭大白兔和大鼠進行免疫，取1ml PBS（其中含有1mg抗原）和等體積的完全弗氏佐劑乳化后在動物背部6個不同的部位進行皮下注射，每只家兔每個部位注射約300μl抗原溶液，每只大鼠每個部位注射約30μl抗原溶液。每兩周免疫一次，連續(xù)4次。首次免疫用完全弗氏佐劑，后三次免疫用不完全弗氏佐劑。
　　 (5)多克隆抗體的檢測及純化。通過蛋白斑點雜交試驗檢測免疫動物血清中是否存在融合蛋白GST-eRF3b-3

8、7抗體。采用Protein A親和層析柱對融合蛋白抗體進行純化，純化后的抗體運用間接ELISA法測定抗體效價，并通過Western-blot方法檢測融合蛋白GST-eRF3b-37抗體的特異性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)GSPT2-111的分子克隆。本研究從人外周血中成功克隆出GSPT2-111基因片段111bp。GSPT2-111編碼37個氨基酸，推測其相對分子質(zhì)量為4.1kDa。
　　 (2)融合蛋白GST

9、-eRF3b-37的表達、可溶性鑒定及純化。含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GSPT2-111大腸桿菌DH5α經(jīng)1.0mM IPTG誘導(dǎo)，出現(xiàn)一分子量約30kDa的新蛋白表達，與GST（分子量為26kDa）和eRF3b-37(分子量約為4.1kDa)的理論分子量相符，并且為可溶性蛋白。通過GST SefinoseTM Resin純化出足夠免疫2只新西蘭大白兔和10只大鼠的融合蛋白，用融合蛋白對動物進行為期兩個月的免疫。
　　 (3

10、)多克隆抗體的檢測及純化。四次免疫后運用蛋白斑點雜交試驗檢測出血清中存在融合蛋白GST-eRF3b-37抗體，再通過間接ELISA法測試抗體效價，純化前的兔抗體效價大于51，200，大鼠抗體效價大于12，800。收集動物血清進行Protein A親和層析柱純化，純化后的兔抗體效價大于384，000，IgG為60mg/ml。純化后的大鼠抗體效價大于25，600，IgG為25mg/ml。Western-blot結(jié)果顯示，無論是兔抗體按1：6

11、000稀釋，還是鼠抗體按1:3000稀釋，純化出的抗體均可檢測出清晰的分子量約為30kDa的GST-eRF3b-37融合蛋白的條帶。
　　 結(jié)論：
　　 (1)克隆出了GSPT2-111基因片段，并且構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GSPT2-111。
　　 (2)表達并且純化出GST-eRF3b-37融合蛋白。
　　 (3)制備并且純化出兔抗人GST-eRF3b-37多克隆抗體和大鼠抗人GST-eRF