睪丸抗原OY-TES-1羧基端截短蛋白的制備及鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建OY-TES-1羧基端截短蛋白(OY-TES-1-C)重組質(zhì)粒、體外表達(dá)OY-TES-1-C蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和鑒定，為OY-TES-1后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)提取人睪丸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)合成cDNA;(2)擴(kuò)增OY-TES-1羧基末端253(S291-G543)個(gè)氨基酸的cDNA序列；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pMAL-C2，構(gòu)建pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DH5α菌

2、進(jìn)行pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒擴(kuò)增；(4)通過(guò)藍(lán)白斑篩選、DNA測(cè)序篩出正確的pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta菌；(5)用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化IPTG使用的濃度和加入時(shí)機(jī)，以及誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間；(6)在優(yōu)化條件下表達(dá)融合蛋白MBP-OY-TES-1-C，通過(guò)Amylose-resin親和層析柱純化；(6)將純化后的MBP-OY-TES-1-C蛋白進(jìn)行Wester

3、n Blot鑒定。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pMAL-C2-OY-TES-1-C測(cè)序與已知序列相同；成功誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白MBP-OY-TES-1-C。確定了pMAL-C2- OY-TES-1-C體外表達(dá)的優(yōu)化條件：37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.7mmol/L)，然后在32℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)；表達(dá)出與預(yù)計(jì)分子量符合的融合蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，通過(guò)E.coli表達(dá)出MB