阿爾茨海默病中β淀粉樣前體蛋白羧基端短肽C31與自噬的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機制尚未明確，目前主流的觀點包括Aβ和Tau蛋白學(xué)說。然而β淀粉樣前體蛋白(APP)除了產(chǎn)生Aβ外，尚可產(chǎn)生其它的多肽片段而參與AD的發(fā)病，這其中包括APP羧基端片段C31。C31是經(jīng)由Caspase在APP第664位位點剪切后產(chǎn)生的短肽，其包含了31個氨基酸片段。已有研究表明，C31具有潛在的神經(jīng)毒性作用，與AD密切相關(guān)。自噬，作為細(xì)胞內(nèi)一種清除不必要的或功能失調(diào)的細(xì)胞組分的基本代謝途徑，在

2、AD發(fā)病過程中同樣扮演著重要的角色。本研究首次探討了C31的毒性作用和自噬的關(guān)系，以及自噬是否介導(dǎo)C31的清除。
　　方法：
　　首先構(gòu)建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry(Vector)質(zhì)粒，然后以此質(zhì)粒為載體構(gòu)建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry-C31(C31)目的質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入不同的細(xì)胞系中，并通過蛋白印跡方法(western blot)分別在不同細(xì)胞細(xì)胞系，包括SH-SY5Y和

3、APPsw穩(wěn)轉(zhuǎn)的HEK293細(xì)胞(APPsw HEK293)中驗證其表達；采用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測C31和對應(yīng)的空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y和APPsw HEK293細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率；分別予促自噬(Rapamycin和Starvation)，下調(diào)自噬(3-MA)以及加入自噬溶酶體抑制劑(CQ和NH4Cl)作用于細(xì)胞，采用western blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3)水平和C31水平。最后，通過免疫共沉

4、淀法，檢測C31是否可以和LC3結(jié)合，并且采用免疫熒光方法檢測C31在細(xì)胞內(nèi)的位置，觀察其是否可以與LC3共定位，以進一步驗證自噬是否是介導(dǎo)C31降解的關(guān)鍵途徑。
　　結(jié)果：
　　在SH-SY5Y和APPsw HEK293細(xì)胞系中，C31質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力顯著低于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。在SH-SY5Y和APPsw HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染C31組和對照組相比，自噬水平無明顯差異；促自噬情況下(Rapamycin和

5、Starvation)，LC3-II的水平比未加藥處理組略增高，但未達到統(tǒng)計學(xué)意義，C31水平相對于空載水平無統(tǒng)計學(xué)差異；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于APPsw HEK293細(xì)胞后，LC3-II水平有輕度降低，但未達到統(tǒng)計學(xué)意義，C31水平相對于空載水平也未達到統(tǒng)計學(xué)意義；加入自噬體和溶酶體融合抑制劑，也即終末抑制劑，氯喹(CQ)和氯化銨(NH4Cl)后，細(xì)胞自噬的水平相對于未加藥處理組，有明顯的增高，且CQ的作用最為明顯

6、，C31水平相對于空載水平明顯增高。在SH-SY5Y細(xì)胞中，結(jié)果類似，但CQ和NH4Cl作用后，C31水平相對于空載水平無統(tǒng)計學(xué)差異。C31能夠促使SH-SY5Y和APPsw HEK293細(xì)胞中APP表達水平升高。C31通過與自噬相關(guān)蛋白LC3結(jié)合，從而錨定到自噬體上，而參與到自噬代謝過程。
　　結(jié)論：
　　C31在SH-SY5Y細(xì)胞和APPsw HEK293細(xì)胞中均能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用。過表達C31能夠促進細(xì)胞中APP