Rab相關(guān)蛋白的自噬-內(nèi)吞異常在阿爾茨海默病神經(jīng)元變性中的作用.pdf

1、目的：
　　以攜帶APP Swedish突變（APP695K595N/M596L）基因的慢病毒感染PC12細(xì)胞制備AD細(xì)胞模型，觀察自噬-內(nèi)吞相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　以APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為對象，研究Rab相關(guān)的自噬-內(nèi)吞異常在AD神經(jīng)元變性過程中的作用。
　　方法：
　　構(gòu)建GV166-APP695K595N/M596L過表達(dá)質(zhì)粒后，與Clontech慢病毒輔助包裝原件載體pHelper1.

2、0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以包裝所獲得的病毒感染PC12細(xì)胞，制備AD細(xì)胞模型。采用免疫熒光及western blot觀察自噬-內(nèi)吞相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。
　　通過PCR技術(shù)鑒定小鼠基因型，將小鼠分為轉(zhuǎn)基因組和野生型對照組。
　　采用水迷宮實驗、強(qiáng)迫游泳實驗，評估12月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠及同齡同窩生野生型小鼠的記憶能力及情緒變化。
　　采用ELISA對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)

3、基因小鼠及對照小鼠腦組織Aβ進(jìn)行檢測。
　　采用免疫熒光觀察APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠和對照野生型小鼠腦內(nèi)Aβ、Rab5、Rab7、LC3B的空間分布及表達(dá)水平。
　　采用western-blot對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型對照小鼠腦內(nèi)的Rab5、Rab7、LC3B及Lamp2蛋白進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果：
　　DNA測序及凝膠電泳證實APP695K595N/M596L成功導(dǎo)入過表

4、達(dá)慢病毒載體系統(tǒng)。包裝獲得的病毒感染PC12細(xì)胞72小時后，western blot及免疫熒光染色顯示，與對照組相比，感染Lenti-APP695K595N/M596L慢病毒的PC12細(xì)胞內(nèi)Aβ含量明顯增高（P=0.011），Rab7含量明顯升高（P=0.019），早期內(nèi)體標(biāo)記物Rab5、自噬泡標(biāo)記物L(fēng)C3B及溶酶體標(biāo)記物L(fēng)amp2均明顯減少（P=0.001,P=0.002,P=0.02）。
　　在水迷宮實驗中，12月齡APPsw

5、e/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的工作記憶能力較野生型對照組小鼠明顯下降（P=0.029），強(qiáng)迫游泳實驗示兩組小鼠無顯著性差異（P=0.100）。
　　12月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ40及Aβ42含量（3601.233±385.001pg/g,546.513±31.626pg/g）較野生型對照組（1331.762±362.982pg/g,261.709±29.817pg/g）顯著增加（P=0.001，P<0.0

6、01）。
　　12月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ與Rab5、Rab7、及LC3B具有共定位關(guān)系，與野生型小鼠相比，上述蛋白表達(dá)水平明顯增加（P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　在攜帶APP Swedish突變基因的PC12細(xì)胞及12月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠中可檢測到一系列Rab及自噬-內(nèi)吞相關(guān)蛋白的異常改變，提示Rab相關(guān)的自噬-內(nèi)吞功能異?？赡茉贏D神經(jīng)元的變性過程中扮演了重要