茶毛蟲核型多角體病毒多角體蛋白基因（polh）的表達(dá)、抗體制備及檢測(cè)利用.pdf

1、桿狀病毒是一類基因組為雙鏈環(huán)狀的DNA病毒，其主要感染節(jié)肢動(dòng)物特別是鱗翅目，雙翅目和膜翅目昆蟲的一類病毒。桿狀病毒科分為核型多角體病毒屬(NPV)和顆粒體病毒屬(GV)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的桿狀病毒以NPV為主，核型多角體病毒根據(jù)病毒粒子中所含核衣殼數(shù)量的多少，從形態(tài)學(xué)上可分為單粒包埋型和多粒包埋型。桿狀病毒是調(diào)節(jié)昆蟲種群密度的重要病原因子，它作為一種生物殺蟲劑，具有病原特異性較高、安全性好、害蟲不易產(chǎn)生抗性，且能在田間長(zhǎng)期控制害蟲種群等諸多優(yōu)點(diǎn)

2、而成為生物防治研究中的熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。茶毛蟲(EuproctispseudoconspersaStrand)是茶樹上的主要害蟲之一，茶毛蟲核型多角體病毒對(duì)茶毛蟲具有高的致病性，已在大田中批量用于防治茶毛蟲。本文選擇茶毛蟲核型多角體病毒的多角體蛋白基因(polyhedringene)進(jìn)行表達(dá)，利用表達(dá)產(chǎn)物制備其抗體，并將抗體應(yīng)用于定量檢測(cè)茶毛蟲病毒，為茶毛蟲核型多角體病毒農(nóng)藥檢測(cè)提供一種方法，也為其它桿狀病毒定量檢測(cè)探索一條途徑

3、。結(jié)果研究如下： 1.采用生物測(cè)定法測(cè)定了茶毛蟲病毒對(duì)茶毛蟲2齡幼蟲的毒力，幼蟲死亡率(y)對(duì)濃度的對(duì)數(shù)值(x)毒力回歸曲線方程為：y=1.3952x-1.7737，相關(guān)系數(shù)r=0.9975(p＜0.01)。 2.以EupsNPV基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)為741bp的ph基因編碼區(qū)片段。將Ep-ph編碼區(qū)插入pET-28-a表達(dá)載體中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28-a-Ep-ph，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE

4、3)，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行了高效的表達(dá)。采用傳統(tǒng)的割膠方法純化目的融合蛋白作為抗原，免疫新西蘭大白兔，制備了EupsNPV的ph抗體，測(cè)得的抗體效價(jià)為6.4×104。 3.對(duì)多克隆抗體的特異性進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，表明制得的抗體特異性良好。間接ELISA檢測(cè)茶毛蟲病毒樣品并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，OD495值(y)對(duì)病毒濃度的對(duì)數(shù)值(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.4152x-0.8229，相關(guān)系數(shù)r=0.9897(p＜