家蠶核型多角體病毒P10蛋白的原核表達(dá)、純化與結(jié)晶條件篩選.pdf

1、桿狀病毒P10蛋白屬于極晚期表達(dá)蛋白，是病毒復(fù)制的非必需蛋白。在感染晚期可以觀察到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有纖維結(jié)構(gòu)的存在，這些纖維結(jié)構(gòu)的形成與P10蛋白有關(guān)。同時(shí)，P10蛋白可能還參與了多角體囊膜的形成，對多角體的穩(wěn)定可能起到一定的作用。后來有免疫學(xué)研究者提出，P10蛋白在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞的骨架元素有相似性，而且能夠與這些元素發(fā)生相互作用。如果能夠得到P10蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，將能更好的研究P10蛋白的各種作用機(jī)制。
　　 本

2、文以大腸桿菌表達(dá)家蠶核型多角體病毒P10蛋白，探索原核表達(dá)的P10蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)晶條件。首先構(gòu)建pET-32a-p10重組表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)。在NaCl濃度超過100mM的溶液中，表達(dá)的His6-P10重組可溶性蛋白經(jīng)4℃靜置8-10h發(fā)生自然沉降，而在不含NaCl的溶液中又會(huì)恢復(fù)到溶解狀態(tài)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這兩種狀態(tài)可逆。Western Blotting和質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定，證明發(fā)生自然沉降的物質(zhì)是重組蛋白His6-P10，通過調(diào)

3、節(jié)溶液中NaCl的濃度獲得較純的重組蛋白。對自然沉降的重組蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以聚體的形式存在于溶液中。為了探索P10蛋白的存在狀態(tài)，構(gòu)建pGEX-6P-1-p10載體，利用prescission protease對重組蛋白進(jìn)行酶切，得到P10蛋白。經(jīng)非變性凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)P10蛋白也是以聚體的形式存在于溶液中。P10蛋白在被感染的宿主細(xì)胞中會(huì)形成纖維結(jié)構(gòu)，而在原核表達(dá)狀態(tài)下會(huì)以聚體的形式存在，說明P10蛋白分子之間

4、可能存在某種相互作用，使其具有這種特性。為了進(jìn)一步推進(jìn)家蠶核型多角體病毒P10蛋白的研究，首先要從P10蛋白的空間結(jié)構(gòu)來解釋該蛋白的上述特性，因此初步篩選了His6-P10重組蛋白和P10蛋白的結(jié)晶條件。
　　 多角體病毒形成的包涵體主要是由多角體蛋白和P10蛋白構(gòu)成，并且形成了多面體結(jié)構(gòu)。為了研究這兩種蛋白在組裝過程中的相互作用，對這兩種蛋白進(jìn)行融合表達(dá)、結(jié)晶和空間結(jié)構(gòu)研究，構(gòu)建pET-28a-polh-p10重組表達(dá)載體，利

5、用多角體蛋白不同pH條件下的溶解特性分離表達(dá)的重組蛋白，并以凝膠過濾層析純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶條件的初篩。
　　 由于本實(shí)驗(yàn)室得到的MnSOD蛋白易于結(jié)晶，因此希望能將P10蛋白與其融合表達(dá)，在MnSOD結(jié)晶堆積的同時(shí)，牽引P10蛋白一起結(jié)晶，進(jìn)而解析P10的空間結(jié)構(gòu)。因此，我們構(gòu)建了pET-28a-MnSOD-p10，得到的重組蛋白經(jīng)過40℃處理、鎳離子金屬螯合親和層析純化，并將純化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶條件的初篩。最后得到MnSOD