EIAV疫苗株gp90基因的多克隆構(gòu)成和體內(nèi)進化與免疫保護的相關(guān)性.pdf

1、中國馬傳貧(EIA)弱毒疫苗，是可良好誘導(dǎo)針對慢病毒的免疫保護并唯一被成功大規(guī)模應(yīng)用的慢病毒疫苗。明確EIA弱毒疫苗致弱和誘導(dǎo)免疫保護的機制，將對慢病毒免疫機制研究和制定疫苗研制策略提供有益的參考。本文選擇中國EIA驢胎皮細胞適應(yīng)性弱毒疫苗EIAVFDDV為研究對象，對該弱毒疫苗的病毒種群構(gòu)成和體內(nèi)復(fù)制特點及二者與誘導(dǎo)免疫保護的相關(guān)性進行了探討。 使用RT-PCR和克隆測序技術(shù)，對EIAVFDDVgp90基因的多樣性進行了分析

2、。隨機獲得的52個gp90基因的不同克隆，同源率在96％-100％不等，推導(dǎo)的氨基酸序列差異最高可達6.5％。該差異結(jié)合進化樹和推導(dǎo)的氨基酸序列的聚類分析結(jié)果，提示經(jīng)過無宿主特異性免疫壓力的長期體外傳代培養(yǎng)得到的EIAVFDDV，其病毒種群存在著豐富的基因多樣性、呈混合構(gòu)成狀態(tài)。我們將該構(gòu)成特性，稱作“多克隆構(gòu)成”。 通過分析免疫成熟過程中不同時間點EIAVFDDV免疫馬匹外周血中EIAVgp90基因的序列，可對多克隆構(gòu)成的E

3、IAVFDDV在免疫馬匹體內(nèi)的進化動態(tài)做如下描述：免疫后15天，EIAVFDDV的部分毒株可以克服宿主的天然免疫壓力對宿主進行感染。2-4個月時，疫苗弱毒株在宿主體內(nèi)以趨于單一的、且可能相對于親本強毒珠出現(xiàn)回復(fù)突變的準(zhǔn)種形式存在。免疫后4-6個月時，趨于單一的、且基因構(gòu)成EIAVFDDV較為相近的病毒種群，將替代2-4個月時發(fā)生突變的病毒種群作為免疫成熟時的準(zhǔn)種，相對穩(wěn)定地存在于宿主血漿中。同時，血漿病毒載量監(jiān)測結(jié)果表明，免疫成熟過程中

4、，外周血游離病毒粒子的RNA拷貝數(shù)在102-105拷貝/ml范圍內(nèi)的低拷貝水平波動。 使用連續(xù)給予地塞米松的方法，對EIAVFDDV免疫成熟馬匹進行了免疫功能抑制，并對比監(jiān)測了免疫抑制前后馬匹血漿中疫苗毒株的載量。監(jiān)測結(jié)果表明，3匹免疫馬在免疫功能受抑制后，2匹血漿中EIAV載量中略有下降，而1匹略有上升，但載量水平均處于免疫馬匹體內(nèi)EIAVFDDV載量變化的正常范圍。該實驗結(jié)果提示，疫苗毒株的生物學(xué)特性，而非免疫壓力是EIA

5、VFDDV在宿主血漿中低拷貝存在的主要原因。而在免疫系統(tǒng)功能受抑制狀態(tài)下，疫苗株在馬體內(nèi)仍維持穩(wěn)定的低拷貝復(fù)制狀態(tài)，支持了疫苗株EIAVFDDV，應(yīng)用中的安全性。 使用EIAVFDDV與基于EIAVFDDV單一毒株基因背景構(gòu)建和拯救出的疫苗感染性克隆毒EIAVFDDV3-8，分別免疫馬匹，并在免疫成熟后進行攻毒。攻毒實驗結(jié)果表明，多克隆構(gòu)成的EIAVFDDV誘導(dǎo)的免疫保護明顯優(yōu)于構(gòu)成相對單一的感染性克隆毒EIAVFDDV3-8