一株海洋細(xì)菌的初步鑒定和相關(guān)功能基因（簇）的克隆.pdf

1、本研究對分離自近海沼澤地大米草根際一株細(xì)菌進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化分析以及16S rDNA的克隆和序列分析，初步鑒定其分類地位歸為海洋單胞菌屬(Marinomonas)。該菌革蘭氏染色呈陰性，直桿狀；基于16S rDNA序列的Blast分析表明，該菌與Marinomonaspontica和Marinomonas dokdonensis的序列相似值分別為97％和95％。其準(zhǔn)確種屬分類地位有待于進(jìn)一步深入的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究和鑒定。 該

2、分離菌株MWYu除能夠降解DMSP(DMSP即是二甲基亞砜丙酸鹽，一種滲透保護(hù)物，主要存在于海洋中，由海洋中的一些浮游植物、藻類、藍(lán)細(xì)菌和海岸植物等產(chǎn)生。它能被細(xì)菌降解產(chǎn)生氣態(tài)二甲基硫化物(DMS)，進(jìn)而從海洋釋放到大氣中，因此在驅(qū)動(dòng)海洋和大氣之間的硫素循環(huán)中具有重要作用)外，還能夠以硝酸鹽、亞硝酸鹽為惟一氮源進(jìn)行生長，可能參與硝酸鹽同化還原(由nas基因控制)或有氧反硝化作用(由硝酸鹽還原酶基因nap、亞硝酸還原酶基因nir控制)。為

3、克隆和研究其相關(guān)功能新基因，進(jìn)而進(jìn)一步闡明其代謝途徑，本研究構(gòu)建了該菌株的基因組fosmid文庫。其基因組DNA的制備和純化采用QIAGEN Genomic-tip 100/G試劑盒完成，文庫的構(gòu)建采用Copy Control Fosmid Library Production Kit進(jìn)行，外源插入片段平均在35-40 kb，文庫初始大小約含1.5-2.0 x 10<'6>克隆。并且，偶然篩選到能夠產(chǎn)生黑色素的陽性克隆，經(jīng)亞克隆得到約1

4、4kb的外源插入片段，對全序列進(jìn)行了測序，并且對功能片段做生物信息學(xué)分析。但是，利用硝酸鹽作為惟一氮源的克隆未能直接篩選到。 由于不能從文庫直接篩選到利用硝酸鹽的陽性克隆，因此，通過Tn5插入突變構(gòu)建了隨機(jī)插入突變庫，采用E.coli S17-1(pUT-miniTn5 Tc)與海洋單胞菌利福平自發(fā)突變株雙親本接合轉(zhuǎn)移，分離到了不能利用硝酸鹽的突變株8株，采用Genomicwalking PCR(Tail-PCR，熱不對稱交錯(cuò)