深海細(xì)菌Shewanella piezotolerans WP3細(xì)胞色素c相關(guān)基因的克隆表達(dá)和功能鑒定.pdf

1、深海是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境，這里永久高壓、低溫、黑暗、高鹽和寡營(yíng)養(yǎng)。生活在這些環(huán)境下的極端微生物必然有特殊的生理代謝途徑來適應(yīng)極端環(huán)境。對(duì)深海微生物的研究不僅有助于了解生命的起源，而且可以了解各種極端微生物的生活特性，為深海微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
　　2003年本實(shí)驗(yàn)室在西太平洋暖池區(qū)1914米的沉積物中分離到一株具有異化金屬還原能力的耐壓低溫細(xì)菌，菌種鑒定為希瓦氏屬新種，命名為 Shewanella piezotolera

2、ns WP3（以下簡(jiǎn)稱 WP3）。WP3全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，并對(duì)其環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制做了功能基因組學(xué)分析。WP3擁有眾多的基因和基因簇來幫助它適應(yīng)極端環(huán)境。特別的是，WP3中包含55個(gè)編碼細(xì)胞色素c的開放讀碼框（ORFs），是目前已測(cè)序Shewanella屬菌株中最多的。
　　通過對(duì)WP3細(xì)胞色素c基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，推測(cè)在異化金屬還原過程中，WP3可能存在兩套電子傳遞系統(tǒng)，即mtrCAB基因簇和mtrFED基因簇。當(dāng)W

3、P3分別以延胡索酸和二氧化錳為唯一電子受體生長(zhǎng)時(shí)，通過提取細(xì)胞總RNA并將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR），確定了細(xì)胞色素c相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果表明，在二氧化錳還原過程下，mtrFED基因簇轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。這說明mtrFED基因簇可能在異化金屬還原過程中起著重要作用。
　　由于WP3的mtrFED基因敲除突變株未觀察到二氧化錳還原能力的顯著下降，推測(cè)mtrFED基因簇在

4、異化金屬還原過程中可能只是起著輔助作用。為證實(shí)mtrFED基因簇在電子傳遞中的作用，首先借助生物信息學(xué)工具，對(duì)mtrFED基因簇的表達(dá)產(chǎn)物即細(xì)胞色素c蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)，包括它們的理化性質(zhì)，跨膜區(qū)段，信號(hào)序列和功能結(jié)構(gòu)域等；隨后設(shè)計(jì)引物，對(duì)細(xì)胞色素c相關(guān)基因在體外進(jìn)行了克隆表達(dá)，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了具有氧化-還原活性的細(xì)胞色素c。
　　同時(shí)，本論文發(fā)展了一種基于刪除信號(hào)肽的策略來過量表達(dá)這些膜蛋白，并采用Qiagen公司的Ni-N