煙草抗病相關(guān)基因EREBP-4的克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在多種與植物生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)環(huán)境刺激的應(yīng)答等相關(guān)生理過(guò)程中扮演非常重要的角色。AP2/ERF基因?qū)Νh(huán)境刺激尤為重要，參與多種應(yīng)答植物激素、生物和非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控途徑，過(guò)量表達(dá)ERF類型基因能誘導(dǎo)PR基因的表達(dá)或其他應(yīng)答機(jī)制，提高植株對(duì)病原物的抗性。煙草是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)也是典型的基因工程模式植物，紅花大金元是目前中國(guó)煙草的主栽品種，從種子、幼苗到成株的生長(zhǎng)及過(guò)程中可能受到病害不同程度的侵染與危害，且種類

2、繁多，造成了每年近十億元的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　EREBP-4是煙草AP2/ERF家族成員，最初由日本的Masaru Ohme-Takagi和Hideaki Shinshi從本生煙中克隆出來(lái)。本研究在紅花大金元中克隆了EREBP-4基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)一步探討了該基因的功能，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　①搜索已報(bào)道的EREBP-4基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR克隆獲得紅花大金元中EREBP-4序列，序列長(zhǎng)度774bp，Bla

3、st比對(duì)結(jié)果顯示本文所克隆的基因序列與Masarud克隆的基因序列的相似性為99％，通過(guò)與其他物種AP2/ERF成員多重比對(duì)和蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示EREBP-4基因與其他物種的AP2/ERF基因高度的同源性。
　?、谕ㄟ^(guò)熒光定量RT-PCR分析，結(jié)果表明EREBP-4的表達(dá)量不同程度的受到ET、SA、NaCl、干旱和冷脅迫等條件的影響。在ET和SA處理中，EREBP-4基因表達(dá)量升高較快，為早期應(yīng)答基因；旱脅迫處理中，ER

4、EBP-4的表達(dá)量在24h才有明顯升高，在旱脅迫后期發(fā)揮作用；冷脅迫處理中，EREBP-4基因表達(dá)量在處理后1h一直保持在本底水平的3倍以上，推測(cè)該基因在抗冷脅迫中整個(gè)過(guò)程發(fā)揮作用。
　?、蹣?gòu)建過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將EREBP-4導(dǎo)入煙草基因組中獲得超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行赤星病病菌和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus TMV）接種，觀察煙草葉片癥狀，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的抗赤星病和煙草花