煙草受激素誘導(dǎo)和逆境脅迫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、煙草(Nicotiana tabacum)是轉(zhuǎn)基因的模式植物，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，每年為國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)，但煙草生產(chǎn)上因受逆境脅迫和病蟲(chóng)危害每年損失很大。分離鑒定煙草受非生物脅迫如激素和環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的功能基因，對(duì)揭示其抗逆分子機(jī)制和煙草抗逆遺傳改良有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)激素、低溫和干旱脅迫已分離獲得三個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和一些抗逆脅迫功能基因，本文在此基礎(chǔ)上研究這些基因的全長(zhǎng)序列和表達(dá)特征，結(jié)果如下：
　　 1．AP2/

2、ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)上具有相似的特征，在調(diào)控乙烯應(yīng)答以及抗病相關(guān)基因的表達(dá)中起重要作用。本研究通過(guò)454測(cè)序分離得到了一個(gè)煙草AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子類基因，通過(guò)RACE方法克隆獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，從煙草基因組擴(kuò)增獲得了其DNA序列，分析了該基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子。對(duì)該基因進(jìn)行了初步生物信息學(xué)分析。同源性分析表明NtAP2/ER目的DNA結(jié)合域是相當(dāng)保守的，進(jìn)化上屬于AP2/E

3、RF家族轉(zhuǎn)錄因子。半定量RT—PCR發(fā)現(xiàn)NtAP2/ERF在煙草各器官中的表達(dá)量差異不大，但在不同處理誘導(dǎo)后的表達(dá)模式不一樣，受乙烯和干旱誘導(dǎo)表達(dá)量較大，說(shuō)明煙草AP2/ERF可能還參與乙烯應(yīng)答以外的脅迫信號(hào)反應(yīng)。
　　 2．通過(guò)基因芯片雜交結(jié)果分離得到了一個(gè)煙草CDI(Cyclin—dependent kinaseinhibitor)類基因，利用RACE方法克隆獲得了該基因的全長(zhǎng)，命名為NtCDI1，該基因核苷酸長(zhǎng)度為：905

4、 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為：211 aa，同時(shí)從煙草基因組擴(kuò)增該基因，獲得了它的DNA序列，長(zhǎng)度為：1405 bp，分析該基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其含有3個(gè)內(nèi)含子。另外對(duì)該基因的相關(guān)生物信息學(xué)進(jìn)行了初步分析，如分子量、等電點(diǎn)、疏水性、同源性、細(xì)胞定位，同源性分析表明該基因的CDI結(jié)構(gòu)域是相當(dāng)保守的。半定量RT—PCR對(duì)該基因的組織器官特異性和不同處理誘導(dǎo)后的表達(dá)模式進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因在煙草不同器官中和不同處理誘導(dǎo)后的表達(dá)量不一樣。
　　

5、3．通過(guò)煙草454測(cè)序分離獲得了一個(gè)含basic helix—loop—helix(bHLH)結(jié)構(gòu)的基因，根據(jù)已知的EST序列設(shè)計(jì)引物，利用RACE技術(shù)克隆了其5’端和3’端未知序列。該基因編碼243個(gè)氨基酸，具有bHLH結(jié)構(gòu)域和LCD1結(jié)構(gòu)域，同源性分析表明，該基因bHLH結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中是相當(dāng)保守的。從全長(zhǎng)cDNA兩頭設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增煙草cDNA和煙草基因組，獲得了該基因不同拷貝的cDNA序列和DNA序列，分析該基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)

6、其有5個(gè)外顯子。半定量RT—PCR分析表明，該基因在煙草根中的表達(dá)量最大，莖、葉、花、果中表達(dá)量小；水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、乙烯利處理和干旱脅迫下該基因表達(dá)量增大，低溫脅迫下該基因表達(dá)量降低。
　　 4．通過(guò)RACE方法克隆了一個(gè)煙草Germin—like基因的全長(zhǎng)cDNA序列，核苷酸長(zhǎng)度為925 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)687 bp，共編碼228個(gè)氨基酸，具有一個(gè)cupin結(jié)構(gòu)域。基因組擴(kuò)增和結(jié)構(gòu)分析表明，該基因含有2個(gè)外

7、顯子和一個(gè)內(nèi)含子。通過(guò)生物信息學(xué)初步揭示了該基因的分子量、等電點(diǎn)、疏水性、細(xì)胞定位、空間結(jié)構(gòu)和同源性。半定量RT—PCR分析表明該基因主要在煙草根中表達(dá)，水楊酸、乙烯利、低溫和干旱處理都能使該基因的表達(dá)量增大，脫落酸對(duì)該基因的表達(dá)量影響不大。構(gòu)建了該基因的病毒誘導(dǎo)沉默載體，為研究該基因的功能提供了條件。
　　 5．通過(guò)煙草454測(cè)序分離得到了一個(gè)LEA基因片段，利用半定量RT—PCR和基因芯片分析了該基因的時(shí)空表達(dá)特征和受多種激