受水稻紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)OsWRKY基因的克隆及初步分析.pdf

1、水稻紋枯病是水稻三大病害之一，近年來(lái)紋枯病危害面積迅速擴(kuò)大，危害程度急劇加重，已嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此對(duì)水稻紋枯病的防治已迫在眉睫。由于引起水稻紋枯病的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)具有強(qiáng)腐生性和寬寄主范圍，利用傳統(tǒng)方法很難找到較高水平的抗源，給水稻紋枯病的抗性研究帶來(lái)一定的困難，因而目前國(guó)內(nèi)外還未深入展開(kāi)紋枯病的抗病機(jī)制和遺傳育種研究。 探討轉(zhuǎn)錄因子在植物防御系統(tǒng)中的功能成為近年來(lái)的研究熱

2、點(diǎn)之一。在植物中發(fā)現(xiàn)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子超家族是因其家族成員N-末端都含有WRKYGQK七個(gè)保守的氨基酸而得名。所有已知的WRKY家族成員均含有一個(gè)或兩個(gè)WR_KY結(jié)構(gòu)域及一個(gè)Cys<,2>His<,2>或Cys2I-IisCys類(lèi)型的鋅指結(jié)構(gòu)基序。目前很多研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝及對(duì)生物或非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。 本論文在水稻紋枯病菌侵染12小時(shí)的水稻組織中克隆出OsWRKY74基因的cDNA，

3、繼而對(duì)OSWRKY74基因的表達(dá)譜進(jìn)行初步的分析，為進(jìn)一步研究OsWRKY74基因在水稻抗紋枯病防御反應(yīng)中的作用打下基礎(chǔ)。 本研究首先對(duì)紋枯病的抗性鑒定方法進(jìn)行了改良。利用文獻(xiàn)報(bào)道的3種抗性鑒定方法接種水稻，發(fā)病率不高，病情也輕重不一。而采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的抗病鑒定方法一菌條法接種水稻葉鞘可達(dá)到100﹪發(fā)病率，而且病情比較均一，重復(fù)性高，能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室的抗病鑒定需要。然后以水稻品種日本晴為材料，用水稻紋枯病菌強(qiáng)致病菌株AG-1-IA

4、進(jìn)行接種，12小時(shí)后取樣提取總RNA。根據(jù)已知WRKY基因家族的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)兩條簡(jiǎn)并引物Pwrkyl和Pwrky2，通過(guò)3’RACE的方法獲得4個(gè)特異性片段，其中Pwrkyl引物擴(kuò)增的片段大小分別為257bp和382bp，Pwrky2引物擴(kuò)增的片段大小分別為485bp和696bp。通過(guò)在Genebank中進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)257bp片段與水稻OsWRKY174基因序列有96﹪以上同源性；而其它片段則可能是由于引物錯(cuò)配得到的非目的

5、片段。為進(jìn)一步研究克隆所得到的WRKY基因的功能，用Noghem blot技術(shù)對(duì)OsWRKY74基因進(jìn)行了表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示OsWRKY74基因在受紋枯病菌接種誘導(dǎo)后12h、24h、36h、60h存在差異表達(dá)，12h時(shí)表達(dá)量最高，24h、36h以及60h時(shí)表達(dá)量已經(jīng)顯著下降至本底水平。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，OsWRKY74蛋白是由361個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，一個(gè)核定位信號(hào)，兩個(gè)SUMO結(jié)構(gòu)域及Cys2His2模式的鋅