水稻紋枯病菌PG基因的克隆、表達(dá)及致病性分析.pdf

1、紋枯病是世界各水稻產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的一種重要病害。其病原菌有性態(tài)為瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk]，無性態(tài)為立枯絲核菌[Rhizoctonia solaniKühn]。該病菌可以侵染水稻、大豆、玉米、大麥、狗牙根和狗尾草等43科200多種植物，引起紋枯和立枯等癥狀。病菌與寄主互作過程中可分泌多種重要的細(xì)胞壁降解酶，并通過這些酶降解寄主細(xì)胞壁，從而達(dá)到侵入寄主的目的，多聚半乳糖醛酸酶

2、則是其中最重要的一種胞壁降解酶。
　　本研究以水稻紋枯病強(qiáng)致病菌株YN-7為研究對(duì)象，采用PCR及RT-PCR方法克隆了3個(gè)完整的多聚半乳糖醛酸酶基因。其中PG6934基因全長(zhǎng)1633bp，包含6個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長(zhǎng)1311bp(KP896519)，編碼436個(gè)氨基酸，前16個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列;PG9039基因全長(zhǎng)943bp，包含4個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長(zhǎng)720bp(KP896520)，編碼239個(gè)氨基酸;PG9605基因全

3、長(zhǎng)1466bp，包含8個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長(zhǎng)1038bp(KP896521)，編碼345個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，PG6934、PG9039和PG9605均含有PG特有的保守結(jié)構(gòu)域NTD、DD、SHG和RIK。其中，PG6934的4個(gè)結(jié)構(gòu)域位于225NTD、248DD、270SHG和310RIK;PG9039的4個(gè)結(jié)構(gòu)域位于58NTD、80DD、101GHG和133RIK;而PG9605的4個(gè)結(jié)構(gòu)域位于130ETD、153DD、1

4、75SHG和211RIK。PG6934的10個(gè)半胱氨酸殘基形成5個(gè)二硫鍵;PG9039的4個(gè)半胱氨酸殘基形成2個(gè)二硫鍵;而PG9605的8個(gè)半胱氨酸殘基形成4個(gè)二硫鍵。三個(gè)PG的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋、β-折疊和卷曲為其基本結(jié)構(gòu)單元，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明它們均以從胞內(nèi)向胞外分泌為主。
　　將3個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因分別連接到原核表達(dá)載體pET-28a，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，無論是上清還是經(jīng)超聲波破碎處

5、理或反復(fù)凍融處理的菌體，均檢測(cè)不到多聚半乳糖醛酸酶活性，包涵體變性復(fù)性后仍不具活性。將3個(gè)新基因和本實(shí)驗(yàn)室以前克隆得到的多聚半乳糖醛酸酶基因RsPG1(KP896518)分別構(gòu)建到真核表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化受體畢赤酵母GS115，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，上清均具有多聚半乳糖醛酸酶活性，工程菌GS-PG6934-7、GS-PG9039-5、GS-PG9605-8和GS-RsPG1-10酶活性最高，分別為101.21U/mL、91.09U/mL

6、、91.09U/mL和267.21U/mL。采用針刺法將粗酶液接種至水稻葉鞘，48h后出現(xiàn)明顯的壞死斑。用4種粗酶液處理四葉期水稻葉鞘，對(duì)水稻葉鞘均可產(chǎn)生浸解作用，處理24h后，還原糖量(OD540)分別為1.387、1.061、1.053和1.664，細(xì)胞損傷率分別為78.4％、62.6％、55.5％和90.0％。Real-time PCR分析表明，這幾個(gè)基因在紋枯病菌侵染水稻過程中，均能上調(diào)表達(dá)，而且以接種后48h表達(dá)量最高，但不同