玉米紋枯病菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆表達(dá)及致病性分析.pdf

1、玉米紋枯病是世界上玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的世界性病害之一，并且已成為我國玉米產(chǎn)區(qū)的主要病害，其主要病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn），在活體上可以產(chǎn)生多種胞壁降解酶，以多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和纖維素酶為主。果膠質(zhì)廣泛存在于高等植物中,是植物細(xì)胞間質(zhì)和初生細(xì)胞壁的重要組分，與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成一個阻擋外界的堅(jiān)韌屏障，在植物細(xì)胞組織中起著“黏合”作用。果膠酶是植物病

2、原物最重要的致病因子之一，是植物病原物破壞植物細(xì)胞壁的主要細(xì)胞壁降解酶之一。
　　 本研究以立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)AG1-IA為研究對象，根據(jù)真菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的同源保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR、快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）及TAIL-PCR的方法克隆了三種內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因。其中pg1全長cDNA為1086bp，包含一個由344個氨基酸組成的開放閱讀框。該基因已在

3、GenBank中注冊，登錄號為HQ413152。Pg2 DNA全長1414bp，包含六個內(nèi)含子區(qū)域，登錄號為HQ156225；全長cDNA為1086bp，共編碼344個氨基酸，登錄號為HQ156226。Pg3 DNA全長1195bp，包含五個內(nèi)含子區(qū)域，登錄號為HQ413151；cDNA全長為927bp，包含一個由309個氨基酸組成的開放閱讀框，登錄號為HQ413150。序列比對分析表明，三個蛋白均屬于糖苷水解酶28家族。
　　

4、 構(gòu)建了畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/pg1、pPIC9K/pg2和pPIC9K/pg3。將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/pg1和pPIC9K/pg3轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得了轉(zhuǎn)酵母工程菌株GS-PG1-4和GS-PG3-18并進(jìn)行純化，純化后的酶液接種玉米葉片,24h后出現(xiàn)水浸狀病斑,72h之后變?yōu)榭莅?，接失活酶液的對照葉片無癥狀，這表明立枯絲核菌(R.Solani Kühn)AG1-IA多聚半乳糖醛酸酶基因pg1和pg3中可能是

5、玉米紋枯病的致病基因。將立枯絲核菌(R.Solani Kühn)AG1-IA接種到玉米葉片上,24h產(chǎn)生暗綠色水漬狀病斑，之后病斑中央灰褐色，邊緣變?yōu)樯詈稚Ｓ萌龡l基因的三對特異引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果1-7天都出現(xiàn)目的條帶，說明內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因參與玉米紋枯病的致病過程。立枯絲核菌(R.Solani Kühn)AG1-IA分別在以果膠和葡萄糖為底物的培養(yǎng)基上生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶三條基因在果膠培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲中1-7