玉米紋枯病菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的基因克隆、表達(dá)及致病性研究.pdf

1、玉米紋枯病是世界范圍內(nèi)玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生的土傳性病害，嚴(yán)重影響世界各國(guó)的玉米生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其主要病原菌是立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)。立枯絲核菌屬絲核菌屬，該屬真菌寄主范圍十分廣泛，能侵染水稻、玉米、大豆、大麥、小麥43科263種植物，引起紋枯、立枯等癥狀。 果膠是植物細(xì)胞初生壁中間層結(jié)構(gòu)的主要成分，它與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成一個(gè)阻擋外界的堅(jiān)韌屏障。植物病原真菌和細(xì)菌都能產(chǎn)生許多降解植

2、物細(xì)胞壁成分的降解酶類，這些酶類成為植物病原真菌和細(xì)菌穿透植物細(xì)胞壁并在植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞之間蔓延的主要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶是降解植物細(xì)胞壁果膠的主要酶之一，在植物病原真菌的致病性中起著重要的作用。 本研究以立枯絲核菌(R.solani Kuhn)AG1-IA為研究對(duì)象，分離該菌產(chǎn)生的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的編碼基因，將該編碼基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍钢?，?gòu)建出高效表達(dá)該基因的生物工程菌株，將純化的目的蛋白接種玉米葉片，從基因和

3、蛋白質(zhì)水平上探索玉米紋枯病菌重要的致病因素。 根據(jù)真菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的同源保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)及TAIL-PCR的方法克隆了立枯絲核菌AG1-IA內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的編碼基因endo-PG1，全長(zhǎng)cDNA為1095bp，包含一個(gè)由364個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框，隨后提取立枯絲核菌AG1-IA的基因組DNA，克隆了endo-PG1的DNA序列，該序列包含五個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。該

4、基因已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為FJ544455，DNA序列的登陸號(hào)為FJ544456。 endo-PG1基因和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K用EcoR I和Not I雙酶切后體外連接，構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/pg1并測(cè)序，保證正確的閱讀框。將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/pg1和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Sal I(位于HIS4區(qū)域內(nèi))線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115酵母感

5、受態(tài)細(xì)胞，于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)及G418抗性篩選多拷貝整合子，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來(lái)篩選高效表達(dá)目的蛋白的工程菌株。篩選到表達(dá)酶活性最高的菌株GS-endoPG-49，甲醇誘導(dǎo)6d酶活性達(dá)到最高。純化真核表達(dá)的目的蛋白接種4-6葉期玉米葉片，設(shè)pH10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液為對(duì)照。24h后目的蛋白接種的葉片部位出現(xiàn)梭形水浸狀病斑，72h后病斑變