受鐮刀菌酸誘導(dǎo)的節(jié)瓜CqWRKY1基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、節(jié)瓜是我國(guó)特產(chǎn)蔬菜之一,也是華南地區(qū)主要蔬菜作物。由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病給節(jié)瓜生產(chǎn)帶來(lái)重大損失。而枯萎病是一種土傳病害,利用化學(xué)防治或輪作等措施難以從根本上消除病害的影響,選育抗枯萎病品種是解決節(jié)瓜枯萎病危害問(wèn)題的根本途徑。對(duì)于節(jié)瓜這類遺傳背景狹窄,變異類型少,抗枯萎病資源缺乏的特色蔬菜,加強(qiáng)其枯萎病抗病機(jī)制的研究,發(fā)掘抗性相關(guān)基因?qū)τ谕苿?dòng)抗病育種工作具有特別重要的意義。
　　WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)超基因家族,在植物抗逆境過(guò)程中

2、起重要的開關(guān)作用。前期課題組構(gòu)建了尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)下抑制差減雜交cDNA文庫(kù),獲得了高質(zhì)量EST序列,其中部分EST序列與WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有較高的相似性。為闡明WRKY在節(jié)瓜抗枯萎病中的作用,本研究在上述研究基礎(chǔ)上獲得了一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了研究;為了精確分析目標(biāo)基因的表達(dá)情況,我們運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)篩選了節(jié)瓜不同實(shí)驗(yàn)條件下合適的內(nèi)參基因。具體結(jié)果如下:
　　1.利用RACE技術(shù)對(duì)一個(gè)推定

3、的WRKY EST序列進(jìn)行克隆,獲得了節(jié)瓜第一個(gè)WRKY基因全長(zhǎng),命名為CqWRKY1。該基因全長(zhǎng)2088bp,開放閱讀框1746 bp,編碼581個(gè)氨基酸。CqWRKY1蛋白氨基酸序列中含有兩個(gè)典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域,鋅指型結(jié)構(gòu)為C2H2(C-X4-C-X22-23-H-X1-H),屬于第I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。
　　2.生物信息學(xué)分析顯示,CqWRKY1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要含有4個(gè)反向平行的β折疊及3個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),在β折疊的

4、末端還有一個(gè)Zn2+結(jié)合口袋;CqWRKY1轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中,并且含有兩個(gè)核定位信號(hào) PTKKKVE、PEAKRWR,具有轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能;同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,節(jié)瓜CqWRKY1蛋白與黃瓜 WRKYP2進(jìn)化關(guān)系最近,且兩者同源性達(dá)92％。
　　3.以4個(gè)常用看家基因(GAPDH、Actin、UBQ、CYP)和2個(gè)新內(nèi)參基因(CACS、F-box)作為候選內(nèi)參基因,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析其在節(jié)瓜不同組織

5、(根、莖、葉)及不同處理下的表達(dá)穩(wěn)定性。經(jīng)RefFinder在線軟件綜合分析,結(jié)果表明,節(jié)瓜經(jīng)鐮刀菌酸脅迫后Actin和F-box表達(dá)都很穩(wěn)定;水楊酸誘導(dǎo)后,表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CACS和UBQ;茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下最合適的內(nèi)參基因也是CACS;而在節(jié)瓜不同組織中F-box蛋白基因表達(dá)穩(wěn)定性最高;另外,傳統(tǒng)常用看家基因GAPDH和CYP在不同試驗(yàn)條件下總體表達(dá)水平都比較差,不適合作為相應(yīng)條件下合適的內(nèi)參基因。
　　4.利用實(shí)時(shí)熒光定