萊氏野村菌微菌核的誘導(dǎo)培養(yǎng)及疏水蛋白基因Nrhyd的克隆與表達(dá)特征分析.pdf

1、昆蟲(chóng)病原真菌是自然界中害蟲(chóng)種群的重要控制因素，由于在害蟲(chóng)持續(xù)控制及維護(hù)物種多樣性方面的特殊優(yōu)勢(shì)，其基礎(chǔ)研究及應(yīng)用均受廣泛關(guān)注。萊氏野村菌是一種世界性廣泛分布的昆蟲(chóng)病原真菌，可侵染多種鱗翅目的農(nóng)作物害蟲(chóng)，此菌在適宜的環(huán)境下可引發(fā)害蟲(chóng)的流行病而使害蟲(chóng)批量死亡，所以具有很大的應(yīng)用潛力。分生孢子是真菌生防制劑的有效成分，生防真菌主要通過(guò)分生孢子侵染害蟲(chóng)。但萊氏野村菌產(chǎn)分生孢子所需要的營(yíng)養(yǎng)條件較苛刻，因此萊氏野村菌的規(guī)模化生產(chǎn)一直未有突破。本課題

2、從以下兩個(gè)方面開(kāi)展研究工作：一是對(duì)產(chǎn)孢相關(guān)基因進(jìn)行克隆與分析以探討萊氏野村菌的產(chǎn)孢機(jī)理，二是尋找易于規(guī)模化生產(chǎn)的有效繁殖體(微菌核)來(lái)代替分生孢子。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①首先對(duì)新分離到的菌株進(jìn)行分類鑒定，將菌株鑒定為萊氏野村菌，編號(hào)為SDNr02。
　　 ②運(yùn)用SMART RACE RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增萊氏野村菌的產(chǎn)孢相關(guān)基因疏水蛋白基因Nrhyd的cDNA全長(zhǎng)序列，利用DNAMAN，Expasy等軟件分析所推導(dǎo)氨

3、基酸序列的基本性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并利用Clustalx和MEGA軟件構(gòu)建Nrhyd因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明萊氏野村菌Nrhyd基因的cDNA全長(zhǎng)序列為733bp，包括339bp的開(kāi)放閱讀框，132bp的上游5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)和262bp的下游3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)。在終止密碼子下游3’-UTR有29bp的PolyA尾結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析表明，擴(kuò)增得到的cDNA序列具有完整的5’端。萊氏野村菌疏水蛋白

4、基因Nrhyd的前體蛋白理論分子量10.6kDa，理論等電點(diǎn)為6.19，共由111個(gè)氨基酸組成。其中包括典型的疏水蛋白功能結(jié)構(gòu)域HYDRO(43-106氨基酸殘基)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Nrhyd基因編碼的蛋白質(zhì)具有18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，選取不同物種的疏水蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示萊氏野村菌的疏水蛋白基因Nrhyd與蝗綠僵菌CQMa102的hyd的親緣關(guān)系最近，其次是金龜子綠僵菌。
　　 ③采用實(shí)時(shí)熒光定

5、量PCR分析Nrhyd因在萊氏野村菌不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Nrhyd基因菌株生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)量差異顯著。在不產(chǎn)孢的液體搖瓶培養(yǎng)條件下，Nrhyd基因表達(dá)量很低呈逐漸降低的趨勢(shì)。在固體培養(yǎng)條件下Nrhyd基因的表達(dá)量隨分生孢子的產(chǎn)生量的變化而變化，產(chǎn)孢量達(dá)到最大時(shí)，Nrhyd基因表達(dá)量最高，隨后伴隨著產(chǎn)孢量的下降，基因的表達(dá)量也開(kāi)始降低，并且呈一直降低的趨勢(shì)。
　　 ④通過(guò)改變培養(yǎng)液中碳濃度及碳氮比(C/N)來(lái)

6、進(jìn)行萊氏野村菌微菌核的誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示2株供試萊氏野村菌CQNr01，SDNr02都可產(chǎn)生除菌絲體外的，纏繞緊密，色素沉著的微菌核結(jié)構(gòu)。
　　 ⑤萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的數(shù)量受培養(yǎng)基成分的影響，低碳濃度的培養(yǎng)液比高碳濃度的培養(yǎng)液產(chǎn)生微菌核的數(shù)量大，CQNr01和SDNr02在低碳培養(yǎng)液中(C濃度4g/L，C/N：20/1)產(chǎn)生的微菌核濃度分別為1.3×104個(gè)/mL，1.2×104個(gè)/mL。在高碳培養(yǎng)液中(C濃度32g/L，C/

7、N：20/1)產(chǎn)生的微菌核濃度分別只有0.8×102個(gè)/mL，0.78×102個(gè)/mL。在等碳濃度下，C/N較高的培養(yǎng)液比C/N低的培養(yǎng)出的微菌核數(shù)量大。而在相同C/N條件下，高碳濃度的培養(yǎng)液(C濃度32g/L，C/N為20:1)產(chǎn)生的生物量(CQNr01和SDNr02分別是37mg/mL，38mg/mL)卻比低碳濃度培養(yǎng)液(C濃度4g/L，C/N為20:1)產(chǎn)生的生物量大(CQNr01和SDNr02分別是30mg/mL，29mg/mL

8、)。
　　 ⑥對(duì)摻加硅藻土制備的微菌核制劑進(jìn)行干燥處理及儲(chǔ)存后進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果表明干燥處理并不影響的微菌核的活性，將干燥處理的微菌核再水化后接種到WA培養(yǎng)基平板上，2d后即可萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，8d后便可產(chǎn)生大量的分生孢子。采用噴霧法進(jìn)行微菌核制劑的毒力測(cè)定，所獲的結(jié)果表明微菌核對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有很高的致死率，接種14d后，供試?yán)ハx(chóng)的校正死亡率可達(dá)80％以上。
　　 結(jié)論：Nrhyd因?yàn)槿R氏野村菌的疏水蛋白基因，該基因可能與