萊氏野村菌微菌核的誘導培養(yǎng)及疏水蛋白基因Nrhyd的克隆與表達特征分析.pdf

1、昆蟲病原真菌是自然界中害蟲種群的重要控制因素，由于在害蟲持續(xù)控制及維護物種多樣性方面的特殊優(yōu)勢，其基礎(chǔ)研究及應用均受廣泛關(guān)注。萊氏野村菌是一種世界性廣泛分布的昆蟲病原真菌，可侵染多種鱗翅目的農(nóng)作物害蟲，此菌在適宜的環(huán)境下可引發(fā)害蟲的流行病而使害蟲批量死亡，所以具有很大的應用潛力。分生孢子是真菌生防制劑的有效成分，生防真菌主要通過分生孢子侵染害蟲。但萊氏野村菌產(chǎn)分生孢子所需要的營養(yǎng)條件較苛刻，因此萊氏野村菌的規(guī)?；a(chǎn)一直未有突破。本課題

2、從以下兩個方面開展研究工作：一是對產(chǎn)孢相關(guān)基因進行克隆與分析以探討萊氏野村菌的產(chǎn)孢機理，二是尋找易于規(guī)?；a(chǎn)的有效繁殖體(微菌核)來代替分生孢子。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①首先對新分離到的菌株進行分類鑒定，將菌株鑒定為萊氏野村菌，編號為SDNr02。
　　 ②運用SMART RACE RT-PCR技術(shù)擴增萊氏野村菌的產(chǎn)孢相關(guān)基因疏水蛋白基因Nrhyd的cDNA全長序列，利用DNAMAN，Expasy等軟件分析所推導氨

3、基酸序列的基本性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并利用Clustalx和MEGA軟件構(gòu)建Nrhyd因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明萊氏野村菌Nrhyd基因的cDNA全長序列為733bp，包括339bp的開放閱讀框，132bp的上游5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)和262bp的下游3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)。在終止密碼子下游3’-UTR有29bp的PolyA尾結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)功能位點和信號肽預測分析表明，擴增得到的cDNA序列具有完整的5’端。萊氏野村菌疏水蛋白

4、基因Nrhyd的前體蛋白理論分子量10.6kDa，理論等電點為6.19，共由111個氨基酸組成。其中包括典型的疏水蛋白功能結(jié)構(gòu)域HYDRO(43-106氨基酸殘基)，信號肽預測結(jié)果表明，Nrhyd基因編碼的蛋白質(zhì)具有18個氨基酸殘基的信號肽序列，選取不同物種的疏水蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示萊氏野村菌的疏水蛋白基因Nrhyd與蝗綠僵菌CQMa102的hyd的親緣關(guān)系最近，其次是金龜子綠僵菌。
　　 ③采用實時熒光定

5、量PCR分析Nrhyd因在萊氏野村菌不同生長狀態(tài)下的表達情況，結(jié)果顯示Nrhyd基因菌株生長發(fā)育的不同時期的表達量差異顯著。在不產(chǎn)孢的液體搖瓶培養(yǎng)條件下，Nrhyd基因表達量很低呈逐漸降低的趨勢。在固體培養(yǎng)條件下Nrhyd基因的表達量隨分生孢子的產(chǎn)生量的變化而變化，產(chǎn)孢量達到最大時，Nrhyd基因表達量最高，隨后伴隨著產(chǎn)孢量的下降，基因的表達量也開始降低，并且呈一直降低的趨勢。
　　 ④通過改變培養(yǎng)液中碳濃度及碳氮比(C/N)來

6、進行萊氏野村菌微菌核的誘導培養(yǎng)，結(jié)果顯示2株供試萊氏野村菌CQNr01，SDNr02都可產(chǎn)生除菌絲體外的，纏繞緊密，色素沉著的微菌核結(jié)構(gòu)。
　　 ⑤萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的數(shù)量受培養(yǎng)基成分的影響，低碳濃度的培養(yǎng)液比高碳濃度的培養(yǎng)液產(chǎn)生微菌核的數(shù)量大，CQNr01和SDNr02在低碳培養(yǎng)液中(C濃度4g/L，C/N：20/1)產(chǎn)生的微菌核濃度分別為1.3×104個/mL，1.2×104個/mL。在高碳培養(yǎng)液中(C濃度32g/L，C/

7、N：20/1)產(chǎn)生的微菌核濃度分別只有0.8×102個/mL，0.78×102個/mL。在等碳濃度下，C/N較高的培養(yǎng)液比C/N低的培養(yǎng)出的微菌核數(shù)量大。而在相同C/N條件下，高碳濃度的培養(yǎng)液(C濃度32g/L，C/N為20:1)產(chǎn)生的生物量(CQNr01和SDNr02分別是37mg/mL，38mg/mL)卻比低碳濃度培養(yǎng)液(C濃度4g/L，C/N為20:1)產(chǎn)生的生物量大(CQNr01和SDNr02分別是30mg/mL，29mg/mL

8、)。
　　 ⑥對摻加硅藻土制備的微菌核制劑進行干燥處理及儲存后進行活性測定，結(jié)果表明干燥處理并不影響的微菌核的活性，將干燥處理的微菌核再水化后接種到WA培養(yǎng)基平板上，2d后即可萌發(fā)長出菌絲，8d后便可產(chǎn)生大量的分生孢子。采用噴霧法進行微菌核制劑的毒力測定，所獲的結(jié)果表明微菌核對斜紋夜蛾幼蟲具有很高的致死率，接種14d后，供試昆蟲的校正死亡率可達80％以上。
　　 結(jié)論：Nrhyd因為萊氏野村菌的疏水蛋白基因，該基因可能與