萊氏野村菌的發(fā)酵工藝與田間應(yīng)用潛力評(píng)測(cè).pdf

1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi (Farlow)Samson）是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌，國(guó)內(nèi)外在該菌的生物學(xué)、流行病學(xué)等研究領(lǐng)域有較多的研究，但在國(guó)內(nèi)至今尚無(wú)商品制劑注冊(cè)。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，對(duì)萊氏野村菌菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，包括萊氏野村菌液體培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察、固體培養(yǎng)基的優(yōu)化與發(fā)酵工藝研究等；
　　 同時(shí)通過(guò)眾多菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選出對(duì)斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（

2、Spodoptera exgua）、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）等3種夜蛾科害蟲(chóng)具有高毒力的菌株，并對(duì)高毒力菌株的田間應(yīng)用技術(shù)及效果進(jìn)行了研究與田間評(píng)測(cè)。
　　 萊氏野村菌的固體發(fā)酵工藝是該菌培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)中的瓶頸問(wèn)題。本研究從萊氏野村菌培養(yǎng)基配方入手，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，以獲得更高的發(fā)酵效率。研究中用單因子篩選法從面粉、大米、黃豆粉、棉子粉、燕麥粉等幾種農(nóng)產(chǎn)品中篩選出萊氏野村菌菌株固體發(fā)酵的最佳基質(zhì)。同時(shí)，

3、通過(guò)在基本培養(yǎng)基質(zhì)中加入不同的黃粉蟲(chóng)粉、酵母粉、蛋白胨等氮源，比較孢子得率，從中篩選出能促進(jìn)萊氏野村菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢的最佳氮源。另外，通過(guò)在篩選出的培養(yǎng)基質(zhì)中加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖等不同的碳源，比較孢子利率，確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在棉籽粉中加入2％的酵母粉和3％乳糖可以作為萊氏野村菌較適宜固體發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量可達(dá)3.32±0.38×108/cm2。
　　 本文對(duì)萊氏野村菌的淺盤(pán)固體發(fā)酵工藝及薄層發(fā)酵工藝進(jìn)行了研

4、究。淺盤(pán)固體發(fā)酵工藝研究中，對(duì)基本培養(yǎng)基大米和碎大豆的發(fā)酵效率進(jìn)行了比較。在基本培養(yǎng)基按25％接種量接種培養(yǎng)3d的萊氏野村菌SMY 培養(yǎng)液，攪拌均勻后，鋪淺盤(pán)進(jìn)行固體發(fā)酵，料厚1cm，然后置于25±1℃下光照培養(yǎng)，培養(yǎng)10d，以使其充分產(chǎn)孢。產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果為：以大米為培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為0.4±0.22×108 孢子/g，而以碎大豆為培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量則達(dá)到6±1.83×108孢子/g。
　　 在薄層發(fā)酵工藝中，以6％的棉籽粉、2％酵母

5、粉、1.5％瓊脂為配方制備培養(yǎng)基，高溫滅菌手噴涂到塑料平板托盤(pán)上，待其冷卻凝固后，噴霧接種萊氏野村菌孢子懸浮液。為避免培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中的水份蒸發(fā)，將接種后的托盤(pán)用保鮮膜密封后，置于25±1℃下光照培養(yǎng)。薄層發(fā)酵工藝在第10d的產(chǎn)孢量可達(dá)2.45±0.16×108孢子/cm2，且此時(shí)薄層噴涂的培養(yǎng)基中已利用充分，極易干燥及收孢。
　　 高毒力萊氏野村菌菌株的篩選是進(jìn)行后繼應(yīng)用研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)。本文在前期粗篩的基礎(chǔ)上，確定了N

6、r03、Nr06、Nr09、Nr11和Nr15等5株萊氏野村菌為進(jìn)一步研究對(duì)象。用噴霧法對(duì)斜紋夜蛾、甜菜夜蛾和棉鈴蟲(chóng)等3 種夜蛾科害蟲(chóng)進(jìn)行進(jìn)一步的室內(nèi)毒力測(cè)定。在孢子懸浮液濃度分別為1×105、1×106、1×107孢子/mL2，噴霧塔霧化接種時(shí)單位面積的孢子附著量為188.9～4048.3 孢子/mm2。時(shí)間-劑量-死亡率模型分析顯示：5株萊氏野村菌菌株Nr03、Nr06、Nr09、Nr11、Nr15在188.9～4048.3孢子/m

7、m2接種量范圍時(shí)，斜紋夜蛾第10d時(shí)的死亡率為60％～95％，其中菌株Nr15對(duì)斜紋夜蛾的毒力水平最高，第10d時(shí)的侵染率達(dá)到95％。Nr15菌株對(duì)斜紋夜蛾的半致死濃度（LC50）為266.7孢子/mm2，而在4048.3孢子/mm2濃度下的半致死時(shí)間（LT50）為5.81d。供試的5株萊氏野村菌菌株對(duì)棉鈴蟲(chóng)與甜菜夜蛾的致病力相對(duì)較弱，侵染率均不足50％。試驗(yàn)結(jié)果表明，萊氏野村菌菌株對(duì)夜蛾科害蟲(chóng)體現(xiàn)出明顯的寄主專(zhuān)化性，對(duì)高毒力菌株呈獻(xiàn)明

8、顯的量效關(guān)系。本研究中篩選出了高毒力的Nr15菌株，可用于斜紋夜蛾生物防治的后繼研究。
　　 萊氏野村菌Nr15菌株的田間試驗(yàn)設(shè)置了1×108、1×107孢子/ml兩個(gè)處理濃度及1個(gè)空白對(duì)照。用超低量噴霧的方法防治白菜上的斜紋夜蛾。每天觀察記錄各小區(qū)每棵植株上的僵蟲(chóng)數(shù)，直至老熟幼蟲(chóng)開(kāi)始化蛹為止。處理前后斜紋夜蛾死亡率（％）和較正死亡率（％）的計(jì)算結(jié)果顯示，在田間處理后第13d，處理濃度為1×107孢子/ml的處理區(qū)，死亡率（％）