斜紋夜蛾QM和PDI基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)萊氏野村菌的免疫應(yīng)答分析.pdf

1、斜紋夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）是世界性分布的暴食性農(nóng)業(yè)重大害蟲，主要在我國(guó)黃河和長(zhǎng)江流域嚴(yán)重發(fā)生。幼蟲取食危害十字花科蔬菜類植物，寄主范圍多達(dá)99科290種以上。鑒于長(zhǎng)期濫用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致蔬菜農(nóng)殘超標(biāo)，害蟲抗藥性增強(qiáng)、生態(tài)失衡等諸多問(wèn)題，微生物農(nóng)藥為主的生物防治受到空前重視。萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）是田間可以引起斜紋夜蛾流行性病害的有價(jià)值的蟲生真菌之一。研究斜紋夜蛾對(duì)萊氏野村菌入侵的

2、免疫應(yīng)答分子機(jī)理，對(duì)于研制更有效的防治斜紋夜蛾的萊氏野村菌真菌劑具有非常重要的意義。本課題基于斜紋夜蛾脂肪體抑制差減雜交文庫(kù)（suppression subtractive hybridization，SSH）篩選到的QM，PDI基因的EST序列著手，分別對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行克隆并研究其與斜紋夜蛾對(duì)萊氏野村菌入侵的應(yīng)答關(guān)系。主要研究結(jié)果：
　?。?）關(guān)于斜紋夜蛾QM基因的研究結(jié)果：
　?、倩谛奔y夜蛾QM基因的EST序列，采用SM

3、ART RACE RT-PCR技術(shù)克隆該基因的cDNA全長(zhǎng)，運(yùn)用ORF finder，SMART和Expasy等軟件推斷其氨基酸序列并分析蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)，利用MegAlign程序?qū)Σ煌锓N的QM進(jìn)行同源性計(jì)算，并通過(guò)Clustalw和MEGA軟件進(jìn)行多序列分析并構(gòu)建QM基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明斜紋夜蛾QM基因cDNA全長(zhǎng)838bp（并命名為SpLQM），含有660bp的ORF，編碼219個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白的分子量

4、為25.6KDa，等電點(diǎn)為10.0；蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，該蛋白含蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)、N-酰基化位點(diǎn)和酰胺化等位點(diǎn)；既沒(méi)有信號(hào)肽也沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。同源性比較與進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾QM蛋白與甜菜夜蛾和粘蟲的親緣最近，氨基酸序列相似性分別高達(dá)99.1％和97.7%；與單細(xì)胞真菌酵母的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，但同源性也達(dá)到60.8%，說(shuō)明QM蛋白具有進(jìn)化的保守性；多序列比對(duì)顯示QM蛋白家族的含有SH3結(jié)合序列和L10核糖體信號(hào)肽均很保守，N端比C端保守。

5、基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，SpLQM基因含有三個(gè)內(nèi)含子。
　?、谕ㄟ^(guò)半定量RT-PCT和熒光定量RT-qPCR的技術(shù)檢測(cè)了SpLQM基因在斜紋夜蛾各組織的表達(dá)特性，結(jié)果表明該基因在所選組織中均有表達(dá)，其中在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，是頭部的58倍；脂肪體次之，為頭部的8倍；在表皮表達(dá)量最低。
　　③收集被萊氏野村菌孢子誘導(dǎo)后的斜紋夜蛾血液觀察發(fā)現(xiàn)，孢子在注入血腔24h還未發(fā)芽，注射48h后開始快速繁殖，而注射72h后不僅形成的蟲菌體迅速

6、繁殖外，而且血細(xì)胞遭破壞變得不完整。同時(shí)，采用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)后表達(dá)特性研究，結(jié)果顯示，SpLQM在脂肪體、血組織和中腸中的mRNA表達(dá)量均有不同程度的增加：在脂肪體中，注射后的6h~12h開始呈上升趨勢(shì)，到24h表達(dá)量達(dá)到最大(為0h的4.6倍），48h開始回落；而在血細(xì)胞中，表達(dá)量6h開始上升，到12h達(dá)到最大(為0h的3.3倍)，24h~48h表達(dá)量逐漸降低；在中腸組織中也有上調(diào)趨勢(shì)，只是增加幅度沒(méi)有在脂肪體和血組織中的

7、大。
　　④分析酶切位點(diǎn)后重新設(shè)計(jì)引物克隆，以pET30(a)為表達(dá)載體，構(gòu)建pET30a-SpLQM重組表達(dá)質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLYsS感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因以包涵體形式表達(dá)，并以切膠回收進(jìn)行初步純化，Western blotting鑒定證實(shí)SpLQM基因在大腸桿菌中正確表達(dá)并得以初步純化。
　　（2）關(guān)于斜紋夜蛾P(guān)DI基因的研究

8、結(jié)果：
　?、俑鶕?jù)篩選的斜紋夜蛾P(guān)DI基因EST序列，采用SMARTRACERT-PCR技術(shù)克隆獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)，通過(guò)上述的軟件進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示斜紋夜蛾P(guān)DI基因cDNA全長(zhǎng)為2367bp(并命名為SpLPDI)，包含一個(gè)1485bp的ORF，編碼494個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為55.3KDa；SpLPDI蛋白含有一個(gè)17個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，兩個(gè)硫氧還蛋白（-CGHC-）的催化活性域和一個(gè)RDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位

9、信號(hào)肽，且具有典型的PDI蛋白家族的a-b-b’-a’-c結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；對(duì)序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在a和a’結(jié)構(gòu)中的CGHC的催化核心序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽均極為保守；進(jìn)化樹分析表明，SpLPDI蛋白屬于第Ⅰ類PDI蛋白簇中，且與家蠶同源性最高為83.0%，與原生動(dòng)物的隱孢子蟲與黑曲霉的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　?、诶冒攵縍T-PCR對(duì)不同組織SpLPDI的進(jìn)行組織分布分析，并進(jìn)一步通過(guò)熒光定量RT-qPCR對(duì)其組織差異性分析。結(jié)果表明，S

10、pLPDI在檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，但在血液中相對(duì)表達(dá)量最高，是頭部表達(dá)量的110倍；脂肪體次之，是頭部的41倍；在頭部表達(dá)量最低。這可能與SpLPDI蛋白在這些組織執(zhí)行某些特殊功能有關(guān)。
　?、壅T導(dǎo)表達(dá)分析表明，在萊氏野村菌誘導(dǎo)后SpLPDI在脂肪體和中腸中表達(dá)均有上調(diào)現(xiàn)象，在脂肪體中誘導(dǎo)后24h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，而中腸中12h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，48h相對(duì)表達(dá)量均有回落，但是在脂肪體的上調(diào)幅度比中腸的大，這可能與真菌入侵的免疫

11、調(diào)控活動(dòng)有關(guān)。
　?、苋コ盘?hào)肽結(jié)合酶切位點(diǎn)分析重新設(shè)計(jì)引物克隆，以pET30(a)為表達(dá)載體，構(gòu)建pET30a-SpLPDI重組表達(dá)質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLYsS感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因以可溶形式表達(dá)，并通過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化，獲得比較純?nèi)诤系鞍祝?biāo)簽與預(yù)測(cè)分子量基本一致。
　　結(jié)論：首次克隆出斜紋夜蛾SpLQM基因與Sp