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1、Gallerimycin基因是鱗翅目昆蟲(chóng)中的一種抗真菌肽,它可以被多種細(xì)菌、真菌甚至金屬蛋白酶誘導(dǎo),在脂肪體中合成,然后分泌到血淋巴中起作用。Gallerimycin主要對(duì)絲狀真菌有明顯活性,對(duì)細(xì)菌和酵母沒(méi)有抗性,在昆蟲(chóng)體液免疫中起重要作用。
斜紋夜蛾是一種鱗翅目蔬菜害蟲(chóng),其幼蟲(chóng)不僅食性雜,而且老熟幼蟲(chóng)會(huì)形成暴食,對(duì)多種蔬菜都有危害。目前防治斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的主要化學(xué)方法仍然是使用化學(xué)農(nóng)藥?;瘜W(xué)農(nóng)藥作為殺蟲(chóng)劑的主要危害是污染環(huán)境;
2、容易使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性;容易殘留在蔬菜上危害人類(lèi)健康。隨著人們的環(huán)保意識(shí)的提高,以及對(duì)生活品質(zhì)要求的提高,化學(xué)殺蟲(chóng)劑的危害逐漸顯現(xiàn)并引起人們的重視。因此萊氏野村菌等蟲(chóng)生真菌的研究和生防應(yīng)用得到越來(lái)越多的關(guān)注。
本研究通過(guò)比對(duì)GenBank中g(shù)allerimycin的蛋白質(zhì)序列,找出gallerimycin氨基酸的保守序列,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,PCR擴(kuò)增其保守區(qū)序列;以gallerimycin基因的保守區(qū)序列作為依據(jù),設(shè)計(jì)特異性引物,采
3、用3’RACE和5’RACE擴(kuò)增斜紋夜蛾老熟幼蟲(chóng)gallerimycin基因的全長(zhǎng)cDNA序列;在獲得gallerimycin基因全長(zhǎng)cDNA的基礎(chǔ)上,通過(guò)表達(dá)譜分析和RNA干擾研究gallerimycin的基因功能。斜紋夜蛾老熟幼蟲(chóng)gallerimycin基因的功能研究,有助于從分子水平上闡明斜紋夜蛾gallerimycin基因在體液免疫中的分子生物學(xué)機(jī)制,這對(duì)于研發(fā)新型生物殺蟲(chóng)劑有重要的指導(dǎo)意義。
1.斜紋夜蛾galler
4、imycin基因的克隆
以被萊氏野村菌CQNr01侵染的斜紋夜蛾老熟幼蟲(chóng)的cDNA作為模板,根據(jù)gallerimycin保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物,通過(guò)PCR獲得一個(gè)86bp的基因片段。通過(guò)NCBI BLAST進(jìn)行生物學(xué)信息分析,結(jié)果表明該片段的基因序列和草地貪夜蛾(Spdoptera frugiperda)有91%的相似性。在斜紋夜蛾gallerimycin基因保守區(qū)序列的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)基因特異性引物,用3’RACE和5’RACE
5、技術(shù)擴(kuò)增得到gallerimycin基因的全長(zhǎng)cDNA序列,GenBank登錄號(hào)為HM747937??寺〉玫降男奔y夜蛾gallerimycin基因cDNA序列長(zhǎng)380bp,開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)225bp,共編碼75個(gè)氨基酸,5’端和3’端非編碼區(qū)分別長(zhǎng)22bp和133bp。該基因編碼的蛋白質(zhì)8.1KDa,等電點(diǎn)8.79,具有一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。進(jìn)化樹(shù)分析和氨基酸序列比對(duì)表明,該基因編碼的產(chǎn)物屬于gallerimycin。其一級(jí)結(jié)構(gòu)具
6、有g(shù)allerimycin的共同特點(diǎn):具有6個(gè)半胱氨酸殘基,形成3個(gè)二硫鍵。
2.斜紋夜蛾gallerimycin基因的表達(dá)譜分析
通過(guò)RT-qPCR測(cè)定斜紋夜蛾老熟幼蟲(chóng)被萊氏野村菌侵染后的不同時(shí)期,gallerimycin基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,gallerimycin基因的表達(dá)是和侵染時(shí)間成線(xiàn)性關(guān)系的。gallerimycin的表達(dá)量隨著侵染時(shí)間的推移逐步上升,到24小時(shí)達(dá)到最大值,隨后又逐步降低。
7、3.gallerimycin基因的RNA干擾分析
根據(jù)gallerimycin基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)干擾引物,通過(guò)Ambion公司的MEGAscript High Yield Transcription Kit試劑盒獲得還有T7啟動(dòng)子的gallerimycin dsRNA。用微型注射器將dsRNA注射入斜紋夜蛾老熟幼蟲(chóng)的腹腔。通過(guò)real-time PCR分析,干擾效率為73%,通過(guò)生物測(cè)定,發(fā)現(xiàn)gallerimycin基因被干擾的
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