甜菜夜蛾抗菌肽基因moricin的克隆和表達.pdf

1、本文通過大腸桿菌JM109誘導(dǎo)甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼蟲，用FastTrack(R)試劑盒提取誘導(dǎo)幼蟲脂肪體mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)GenBank登錄的moricin序列(No.AY611631)設(shè)計特異性PCR引物擴增獲得了甜菜夜蛾的抗菌肽基因moricin。計算機軟件分析表明，moricin編碼區(qū)長204bp，編碼67個氨基酸，預(yù)期分子量為7.2kDa，SignalP預(yù)測結(jié)果顯示，在Moricin的起

2、始密碼子開始的氨基酸序列中有信號肽存在，可能的切割位點是第24和25位殘基之間，Blast比較Moricin蛋白與其他鱗翅目昆蟲的Moricin蛋白后發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾Moricin蛋白與斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、家蠶(Bombyxmori)、煙草天蛾(Manducasexta)、化香夜蛾(Hyblaeapuera)以及煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)Moricin蛋白的一致性分別為98％、69％、79％

3、、69％和76％。另外利用actin的管家基因特性來作為轉(zhuǎn)錄的陽性對照研究moricin的轉(zhuǎn)錄情況，轉(zhuǎn)錄時相分析發(fā)現(xiàn)，moricin有本底轉(zhuǎn)錄，而且轉(zhuǎn)錄持續(xù)到12h；組織特異性轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，moricin在血細(xì)胞、脂肪體、中腸、上皮等組織中都有轉(zhuǎn)錄。 參照Moricin類抗菌肽由42個氨基酸殘基組成，以及計算機軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Moricin有24-25個氨基酸長度的信號肽序列的特點，通過設(shè)計引物，用PCR的方法從甜菜夜蛾mori

4、cin序列中獲得了C-末端42個氨基酸，分子量大小為4.6kDa的DNA片段，并與斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus，SpltMNPV)泛素基因融合，將融合片段克隆至原核表達質(zhì)粒pQE30，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pQE-SeMU。重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Western印跡分析表明，融合蛋白的大小為15kDa，與預(yù)期大小一致，表明該融合蛋白在大腸桿菌中得到高效

5、表達。融合蛋白的可溶性分析表明，目的蛋白為可溶；用6×His蛋白純化試劑盒非變性純化后，獲得一條特異的蛋白帶，大小與預(yù)期分子量一致，泛素蛋白水解酶酶切融合蛋白后，初步抗菌活性測定顯示，Moricin對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有較強的抑制活性。 為了進一步研究不同表達載體之間對moricin的表達效率的影響，進行了Moricin的C-末端42個氨基酸與GST(glutathione-S-trans