兩型性萊氏野村菌交替氧化酶(AOX)基因的克隆及功能研究.pdf

1、蟲(chóng)生真菌因在防治農(nóng)林害蟲(chóng)時(shí)具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、無(wú)殘留和使害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，是一種環(huán)境友好型真菌。隨著人們對(duì)環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，利用蟲(chóng)生真菌防治農(nóng)林害蟲(chóng)受到人們的廣泛關(guān)注及重視。萊氏野村菌在田間能夠自然侵染多種夜蛾科害蟲(chóng)并引起域內(nèi)流行病，是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌。萊氏野村菌作為殺蟲(chóng)劑的有效成分是分生孢子，但是由于其產(chǎn)孢條件比較苛刻如需要苛刻的碳源（麥芽糖）和持續(xù)光照，其工業(yè)化生產(chǎn)方面一直受到極大限制，所以尋找該菌的其他繁殖體來(lái)代替分生孢

2、子行使殺蟲(chóng)作用具有十分重要的意義。液體發(fā)酵產(chǎn)生的芽生孢子雖然有一定侵染力，但因其細(xì)胞壁比較薄、不耐儲(chǔ)存以及毒力低等特點(diǎn)也不能用于生產(chǎn)實(shí)踐。微菌核是真菌菌絲聚集而形成特異休眠體結(jié)構(gòu)，它具有耐儲(chǔ)存、抗逆性強(qiáng)、在適宜的環(huán)境下能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲和孢子。重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室成功的誘導(dǎo)出萊氏野村菌的微菌核，并對(duì)其的抗逆性和毒力等進(jìn)行了測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該微菌核可以作為有效的活性成分來(lái)代替分生孢子用于害蟲(chóng)的生物防治制劑。其后，采用比較轉(zhuǎn)錄組技

3、術(shù)從分子層面來(lái)探討微菌核形成機(jī)理，發(fā)現(xiàn)在微菌核形成與氧脅迫密切相關(guān)，并且在微菌核形成的過(guò)程中大量的還原性酶或合成還原性物質(zhì)的基因上調(diào)表達(dá)。依據(jù)此，本課題從比較轉(zhuǎn)錄組上調(diào)表達(dá)的cDNA文庫(kù)中挑取Nraox基因的EST序列，將其克隆并采用RNA干擾技術(shù)來(lái)研究該基因在微菌核發(fā)育過(guò)程中的作用。主要研究結(jié)果如下：
　?、偃R氏野村菌Nraox基因的克隆與序列分析根據(jù)萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中Nraox基因的EST序列，克隆得到該基因的cDNA全長(zhǎng)序

4、列（GenBank登錄號(hào)：No.KM978957）。序列分析顯示其開(kāi)放閱讀框?yàn)?068bp，編碼355個(gè)氨基酸；生物信息學(xué)分析表明該蛋白的理論分子量為40.517KD，理論等電點(diǎn)為9.53；該蛋白具有親水性，無(wú)信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位分析該蛋白定位于線粒體內(nèi)。Nraox的基因組全長(zhǎng)為1512bp，該基因含有3外顯子，2內(nèi)含子。利用DNAMAN和MEGA軟件進(jìn)行同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，萊氏野村菌的AOX蛋白與綠僵菌的同源性最高，并與麥角菌科

5、的真菌聚為一組，同源性都達(dá)到88.17％。
　?、谌R氏野村菌Nraox的表達(dá)分析收集萊氏野村菌微菌核發(fā)育不同時(shí)期的樣品，采用熒光定量qPCR的方法對(duì)Nraox基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因在微菌核發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá)，并在微菌核形成初期表達(dá)量最高，然后降低；采用qPCR技術(shù)檢測(cè)Nraox在氧脅迫誘導(dǎo)劑處理后的基因表達(dá)，研究結(jié)果表明，氧化劑H2O2和甲萘醌都能引起該基因的高度上調(diào)表達(dá)，H2O2處理后Nraox表達(dá)量是對(duì)照組

6、的7倍，甲萘醌處理后是對(duì)照組的20倍。
　?、垡种苿┨幚韺?duì)交替氧化酶功能的驗(yàn)證采用交替氧化酶的特殊抑制劑SHAM處理后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫含量變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，抑制劑SHAM處理后前10min中內(nèi)細(xì)胞內(nèi)H2O2較高，處理15min后沒(méi)有明顯變化；但是，顯微觀察菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，處理組菌絲表現(xiàn)為彎曲和很多芽狀結(jié)構(gòu)的不正常生長(zhǎng)狀態(tài)；而誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的微菌核表現(xiàn)為微菌核的形成延遲、微菌核顆粒直徑較大以及微菌核結(jié)構(gòu)松散、

7、表面比較蓬松。由此可以確定，抑制劑處理后減緩了細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的清除速度，并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的氧毒害。
　?、躌NA干擾技術(shù)驗(yàn)證Nraox基因功能利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)不同濃度siRNA的干擾效率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示800nMsiRNA能夠有效下調(diào)Nraox基因的表達(dá)，并且該基因表達(dá)量下調(diào)了約76.1%。與對(duì)照組相比，干擾菌株在含有脅迫誘導(dǎo)劑的固體SMAY培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落生長(zhǎng)緩慢，菌落變小，產(chǎn)孢量降低。而在微菌核誘導(dǎo)培養(yǎng)基AM中

8、生長(zhǎng)時(shí)，Nraox基因干擾后的微菌核表型發(fā)生了明顯變化，主要表現(xiàn)為：與野生菌相比，微菌核的形成推遲，微菌核顆粒的直徑變大，質(zhì)地較為疏松；微菌核的生物量和產(chǎn)量顯著性降低；顯微觀察發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，干擾后的萊氏野村菌菌絲顯示畸形生長(zhǎng)，表現(xiàn)為菌絲上生出很多芽狀結(jié)構(gòu)；這些結(jié)果表明，Nraox參與了萊氏野村菌微菌核的形成調(diào)控。
　　⑤干擾菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的致病性鑒定采用點(diǎn)滴法測(cè)定干擾菌株微菌核對(duì)三齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的侵染和致病能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾