萊氏野村菌Nrssk1與Nrpbs2基因的克隆和功能研究.pdf

1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi=Metarhizium rileyi）是一種分布廣泛的蟲(chóng)生真菌，因其在自然環(huán)境中可以感染多種鱗翅目的害蟲(chóng)，可以作為潛在的生物殺蟲(chóng)劑而逐漸受到關(guān)注。但是萊氏野村菌分生孢子的產(chǎn)孢需要一定的光照溫度等苛刻條件，且不耐儲(chǔ)存，這對(duì)于以分生孢子作為殺蟲(chóng)制劑有效成分的真菌來(lái)說(shuō)，是制約其工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究成功實(shí)現(xiàn)了萊氏野村菌微菌核的人工誘導(dǎo)，微菌核具有生產(chǎn)成本低、耐高溫、耐儲(chǔ)存、可持

2、續(xù)侵染等特點(diǎn)，因此可以作為分生孢子的有效替代品用于殺蟲(chóng)制劑的生產(chǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室在2012年采用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究微菌核形成的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)在微菌核發(fā)育過(guò)程中伴隨著活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生。而已有研究表明真菌在應(yīng)對(duì)外部滲透和氧脅迫壓力時(shí)，兩個(gè)跨膜蛋白Sholp和Sln1p發(fā)揮重要的感受作用，這兩個(gè)蛋白分別將信號(hào)傳遞給高滲透壓甘油信號(hào)途徑(High osmolarity glycerol

3、，HOG)。另一方面，前期研究表明，萊氏野村菌Nrsho1和Nrsln1基因在調(diào)控微菌核的發(fā)育方面發(fā)揮著重要功能。鑒于此，本文以萊氏野村菌為研究對(duì)象，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組EST庫(kù)信息，成功克隆得到HOG通路中Nrsho1與Nrsln1的下游基因Nrssk1與Nrpbs2基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了單敲除，并研究其基因功能，得到如下的研究結(jié)果：
　?、貼rssk1與Nrpbs2基因的克隆與序列分析

4、>　　根據(jù)萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)Unigene序列，成功克隆出了萊氏野村菌Nrssk1與Nrpbs2基因的部分序列，并利用FPNI-PCR方法擴(kuò)增得到其基因全長(zhǎng)序列，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：Nrssk1開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2929bp，含有2個(gè)內(nèi)含子，編碼929個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為100.2kDa，理論等電點(diǎn)為10.04；Nrpbs2開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2038bp，含有1個(gè)內(nèi)含子，編碼649個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為68.5kDa，理論等電點(diǎn)為5.80。

5、其二級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲和α螺旋為主要構(gòu)象。Nrssk1p隸屬于REC超家族，該家族蛋白含有信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域；Nrpbs2p隸屬于類(lèi)PKc超家族，該蛋白激酶超家族主要由絲氨酸/蘇氨酸特異性和酪氨酸特異性蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域組成。經(jīng)過(guò)同原序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析，我們發(fā)現(xiàn)Nrssk1與Nrpbs2基因在進(jìn)化關(guān)系上與綠僵菌屬ssk1與pbs2基因有最近的親緣關(guān)系。
　?、贜rssk1與Nrpbs2敲除載體構(gòu)建和突變菌株篩選
　　采用同源

6、雙交換的方法，通過(guò)FPNI-PCR的方法擴(kuò)增兩個(gè)基因編碼區(qū)相鄰的上下游同源序列，結(jié)果分別擴(kuò)增得到1500bp左右的未知序列，并以此構(gòu)建得到Pzp-Ptrpc-Hph-Nrssk1和Pzp-Ptrpc-Hph-Nrpbs2基因敲除載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化萊氏野村菌芽生孢子，篩選得到了突變菌株△Nrssk1與△Nrpbs2。
　?、弁蛔兙甑谋硇头治?br>　　分析兩個(gè)突變菌株的表型相對(duì)于野生型菌株的變化，我

7、們發(fā)現(xiàn)，△Nrpbs2整體生長(zhǎng)進(jìn)程特別是分生孢子萌發(fā)的前期相較于野生型明顯延遲，在培養(yǎng)后期，菌絲豐厚，分生孢子梗分叉較多，產(chǎn)孢困難，產(chǎn)孢量較野生型顯著降低?！鱊rssk1相較于野生型在菌體發(fā)育方面沒(méi)有明顯變化。在逆境脅迫實(shí)驗(yàn)中，△Nrpbs2對(duì)滲透壓脅迫敏感，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，且對(duì)鹽離子濃度的極限耐受力下降。在應(yīng)對(duì)氧脅迫，尤其是在甲萘醌提供的氧脅迫環(huán)境中，△Nrpbs2的生長(zhǎng)受到了較大的限制，其生長(zhǎng)進(jìn)程發(fā)生了較明顯的延遲。而△Nrssk

8、1則只有在較高程度的滲透壓脅迫和氧脅迫下，菌落才出現(xiàn)了較野生型明顯的變化，菌株的生長(zhǎng)受到限制，產(chǎn)孢量不同程度的下降。另外，兩個(gè)突變菌株對(duì)濕熱脅迫均不敏感。在微菌核的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，相比于野生型微菌核，△Nrssk1的微菌核相比于野生型微菌核，色素沉積下降，且致密程度也變得更為疏松；這一點(diǎn)在△Nrpbs2菌株中變得更為明顯，其色素的下降程度可在肉眼觀察下感知。并且，兩個(gè)突變菌株在微菌核的產(chǎn)量（數(shù)量）及總生物量上均有顯著下降。以上說(shuō)明兩個(gè)基因?qū)?/p>

9、萊氏野村菌應(yīng)對(duì)多種壓力脅迫以及微菌核的正常生長(zhǎng)發(fā)育是必須的。
　?、躈rssk1與Nrpbs2表達(dá)模式分析
　　收集萊氏野村菌在微菌核發(fā)育的幾個(gè)時(shí)期的樣品，并利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析兩個(gè)基因在這幾個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nrssk1與Nrpbs2兩個(gè)基因萊氏野村菌微菌核發(fā)育過(guò)程中有著相似的表達(dá)趨勢(shì)，在微菌核誘導(dǎo)的初期36h，兩基因均有較高水平的表達(dá)，之后均有下降，并在第84h達(dá)到最高的表達(dá)水平，此時(shí)正處于微菌核形成的

10、高峰期，這說(shuō)明兩基因均參與微菌核的發(fā)育并發(fā)揮了一定的作用。
　　當(dāng)以突變菌株進(jìn)行微菌核的誘導(dǎo)并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因缺失對(duì)其他基因的影響時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)兩基因會(huì)在一定程度上協(xié)同發(fā)揮作用，并與CWI通路發(fā)生作用互補(bǔ)。
　?、萃蛔兙甓玖Ψ治?br>　　將突變菌株的分生孢子分別以體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射的方式侵染斜紋夜蛾三齡幼蟲(chóng)測(cè)定突變菌株的毒力變化，結(jié)果表明，△Nrssk1菌株的半致死時(shí)間LT50分別為6.18d和6.43d相比野

11、生型增長(zhǎng)了1.18d和1.36d；△Nrpbs2菌株的半致死時(shí)間LT50分別為6.83d和6.97d，相比對(duì)野生型菌株增長(zhǎng)了1.83d和1.90d。這說(shuō)明兩基因均在一定程度上影響這萊氏野村菌對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的侵染毒力。
　　⑥結(jié)論
　　以上結(jié)果表明，Nrssk1與Nrpbs2兩個(gè)基因在萊氏野村菌應(yīng)對(duì)外界脅迫、微菌核的發(fā)育以及菌株的毒力方面均發(fā)揮一定的作用，且其功能又有相似之處，但發(fā)揮作用的程度并不一樣，而這也是符合兩基因在HO