福氏志賀氏菌耐藥相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及蛋白純化與結(jié)晶的初步研究.pdf

1、在細(xì)菌耐藥研究中有關(guān)細(xì)菌主動(dòng)外排泵的研究是相對(duì)活躍的領(lǐng)域。外排泵是微生物對(duì)藥物和其他外來物質(zhì)產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制，其中acrAB-to1C是一種常見的外輸泵，是由藥物外輸?shù)鞍譇crA、 AcrB和調(diào)節(jié)蛋白MarA調(diào)控作用來完成的。 本研究對(duì)福氏志賀菌多藥耐藥相關(guān)基因marA、aerA和acrB的克隆、蛋白表達(dá)、純化及結(jié)晶進(jìn)行研究。根據(jù)已有數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)marA、aerA和aerB基因引物，提取基因組DNA并通過PCR擴(kuò)增目的基因

2、，構(gòu)建克隆載體后，分別將目的基因片段通過BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)插入表達(dá)載體pET-30a。經(jīng)酶切鑒定及序列測(cè)定表明，目的基因片段連接正確，按正確的讀碼框插入表達(dá)載體中，其核苷酸序列與報(bào)道的marA和acrA基因的同源性為100％，acrB基因同源性為99.7％。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLys，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明，marA和aerA基因成功地在大腸埃希氏菌中得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小分

3、別約為21kDa和45kDa。通過可溶性分析得知acrA為可溶性表達(dá)蛋白，marA以包涵體形式表達(dá)。利用高濃度尿素裂解包涵體，采用稀釋法和氧化型、還原型谷胱甘肽系統(tǒng)相結(jié)合方法對(duì)marA蛋白進(jìn)行復(fù)性。用金屬鰲合親合層析的方法對(duì)表達(dá)的marA和acrA蛋白進(jìn)行純化和濃縮純化蛋白，測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度為5 mg/mL，試驗(yàn)獲得了能夠結(jié)晶的高濃度蛋白。 采用懸吊液滴蒸汽擴(kuò)散法，對(duì)蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。觀察發(fā)現(xiàn)，在多種結(jié)晶條件下出現(xiàn)了晶體，