透明顫菌血紅蛋白基因在弗氏鏈霉菌中的克隆與表達(dá).pdf

1、弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的產(chǎn)生菌,它嚴(yán)格好氧,其發(fā)酵液由于較粘稠而導(dǎo)致溶氧較差,因此溶氧成為泰樂菌素產(chǎn)量提高的限制性因素之一.該研究旨在通過在弗氏鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因(vhb)來改善氧的傳遞,進(jìn)而改善菌體生長(zhǎng),提高泰樂菌素的產(chǎn)量.pIJ8600是能整合于鏈霉菌染色體的表達(dá)載體,其含有鏈霉菌噬菌體oC31整合性位點(diǎn),并擁有能被硫鏈絲菌素誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子(P<,tipA>).將vhb基因置于P<,tipA>之下,構(gòu)建成vhb基因表達(dá)載

2、體pWQ2005,通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入弗氏鏈霉菌中,PCR驗(yàn)證表明vhb基因成功整合到染色體上,經(jīng)硫鏈絲菌素誘導(dǎo)后,CO結(jié)合差光譜分析顯示,pWQ2005表達(dá)出有生物活性的VHb蛋白.搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)初步證實(shí),VHb蛋白的表達(dá)可明顯促進(jìn)泰樂菌素的合成與菌體的生長(zhǎng),但不同誘導(dǎo)時(shí)間產(chǎn)生的作用效果差異顯著.pSET152與pIJ8600屬同一類型的載體,但其不含用以表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子;該研究利用其構(gòu)建成含自身啟動(dòng)子的vhb基因表

3、達(dá)載體pWQ1116,但vhb基因在限氧條件下卻未在弗氏鏈霉菌中表達(dá),這可能是弗氏鏈霉菌的RNA聚合酶不能識(shí)別該啟動(dòng)子.紅霉素抗性基因啟動(dòng)子(P<,ermE>)是能在鏈霉菌中組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子.應(yīng)用SOE-PCR(Splicing of Overlap Extension by PCr)將不含自身啟動(dòng)子的vhb基因置于P<,ermE>之下,利用P<,ermE>表達(dá)vhb基因.為使vhb基因在弗氏鏈霉菌中更好的表達(dá),對(duì)其進(jìn)行了定點(diǎn)誘變,

4、構(gòu)建成經(jīng)誘變的vhb基因表達(dá)載體pWQ2004和pWQ1023,并構(gòu)建成未誘變的vhb基因表達(dá)載體pWQ1118作對(duì)照;CO結(jié)合差光譜分析顯示,三者在弗氏鏈霉菌中均表達(dá)出有生物活性的透明顫菌血紅蛋白(VHb),但與對(duì)照相比,經(jīng)誘變的vhb基因表達(dá)量有所提高.候選接合子(Streptomyces fradiae/p WQ2004)經(jīng)初篩后,進(jìn)行的搖瓶與5L罐發(fā)酵結(jié)果初步顯示,VHb蛋白的表達(dá)顯著促進(jìn)泰樂菌素合成與菌體的生長(zhǎng),這種作用越是在