透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白對芳香族污染物清除作用的實驗研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟和生產(chǎn)力的不斷發(fā)展，工業(yè)三廢的無節(jié)制排放、粉塵和酸雨的侵蝕、化肥農(nóng)藥殺蟲劑的大量施用等，大量的污染物被排放到空氣、土壤和水中。但是，自然界對這些污染物的降解能力有限，水中的芳香族化合物及有機營養(yǎng)物的增多，導(dǎo)致水生動物變異，滅絕。
　　我國野生動物生境中苯系物的污染非常廣泛，對水生生境中的野生動物造成了嚴重的危害。目前，對水污染的處理主要可分為三類:物理法、化學(xué)法和生物法，生物法又包括微生物法和生物酶法。國內(nèi)使用生物酶法

2、清除苯系物的研究尚處于起步階段。
　　生物酶法是利用酶的催化作用來加速清除有機物的方法，過氧化物酶類就是生物酶法中的一種能清除水中污染的酶。2002年Bhunia等發(fā)現(xiàn)，染料對辣根過氧化物酶的抑制作用導(dǎo)致天然過氧化物酶對亞甲基蘭及苯酚的清除速率較低。如何解決這一問題呢？這在酶來源上對我們提出了挑戰(zhàn)。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)是一個來源于專性好氧的Vitreoscilla中的細菌球蛋白

3、。近期研究發(fā)現(xiàn)它具有類過氧化物酶活力，透明顫菌血紅蛋白可以催化各種芳香族類的底物。因此透明顫菌血紅蛋白作為類過氧化物酶在水污染治理中具有很大的應(yīng)用潛力。為此，開展了下述實驗研究:
　　1.將含有透明顫菌血紅蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)在低氧條件下進行表達。SDS-凝膠電泳在14.3KD左右的電泳亮帶表明透明顫菌血紅蛋白已被成功表達。細胞破碎液經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析、分子篩柱層析等純化步驟后，制備的透明顫菌血紅蛋白的紫

4、外特征吸收峰在402nm及280nm處，Rz值大于3.0。將得到的透明顫菌血紅蛋白通過鐵氰化鉀氧化，進行全氧化態(tài)的制備，紫外吸收光譜證實了上述樣品的全氧化態(tài)。
　　2.為探索透明顫菌血紅蛋白不同突變體對苯系物污染物（不同底物）的選擇性和清除效率，進一步設(shè)計了透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H，P54C，Q53H/P54C并純化制備了相應(yīng)的蛋白。差熱分析等實驗表明，透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C蛋白的熔化溫度（熱穩(wěn)定性）高于辣

5、根過氧化物酶、透明顫菌血紅蛋白和透明顫菌血紅蛋白突變體(Q53H、P54C)蛋白。
　　3.鑒于亞甲基蘭是紡織工業(yè)廢水中常見的污染物質(zhì)，為此我們優(yōu)化了透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白(Q53H，P54C，Q53H/P54C)在不同PH、溫度和H2O2濃度下的亞甲基蘭清除效率。結(jié)果表明:在pH7.5，H2O27.5 mM的條件下，透明顫菌血紅蛋白清除亞甲基蘭的效率比辣根過氧化物酶高5.7倍，而透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C對

6、亞甲基蘭的清除率比透明顫菌血紅蛋白高1.4倍;與辣根過氧化物酶相比較，透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C具有更好的熱穩(wěn)定性、更佳的pH穩(wěn)定性和H2O2抗性。認為經(jīng)定點突變后透明顫菌血紅蛋白突變體清除效率的增高暗示著將透明顫菌血紅蛋白遠端口袋E7位置的谷氨酰胺替換為組氨酸后，引入的組氨酸將導(dǎo)致螺旋含量的增加，這將導(dǎo)致組氨酸被推向血紅素平面，使得卟啉周圍的結(jié)構(gòu)更靠近反應(yīng)部位。
　　4.苯胺、三氯苯胺、苯酚、三氯苯酚是苯系物中有代

7、表性的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類生活污染的排放物。針對不同的底物，在優(yōu)化最適pH及最適溫度的基礎(chǔ)上，比較透明顫菌血紅蛋白及其突變體Q53H，P54C，Q53H/P54C對不同苯系物清除效率上的差異。實驗結(jié)果表明:在以苯胺、2，4，5-三氯苯胺、苯酚為底物時，透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H表現(xiàn)出最高的清除效率;在以三氯苯酚為底物時，透明顫菌血紅蛋白突變體P54C表現(xiàn)出最高的清除效率。說明透明顫菌血紅蛋白遠端口袋位置經(jīng)分子改造后，能改善其對不同苯系物

8、底物的選擇性。在處理含有苯系物的污水時，可針對不同的底物，選用清除效率最佳的突變體進行治理。
　　綜上所述，本研究在分子水平上對透明顫菌血紅蛋白及其突變體P54C，Q53H，Q53H/P54C蛋白對動物生境中的可能污染物亞甲基蘭，芳香族有機化合物苯酚、苯胺、2，4，5-三氯苯胺和2，4，6-三氯苯酚的清除作用進行了探索。通過定點突變的技術(shù)，改變了透明顫菌血紅蛋白血卟啉周圍的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，這一變化可能改變配基對血卟啉的親和力，從

9、而改善透明顫菌血紅蛋白對底物的催化活力。獲得了對亞甲基蘭具有更高清除效率的Q53H/P54C突變體，對苯酚、苯胺、2，4，5-三氯苯胺具有更高清除效率的Q53H突變體，以及對2，4，6-三氯苯酚具有更高清除效率的P54C突變體。
　　透明顫菌血紅蛋白是微生物來源的類過氧化物酶，在來源方面廣泛，成本低，污水中的一些污染物也不會對其造成抑制作用。因此透明顫菌血紅蛋白作為過氧化物酶在水污染中具有很大的開發(fā)價值，可以為野生動物生境中的苯類