實(shí)驗(yàn)七血紅蛋白和血型的測定

1、人體血紅蛋白和血型的測定,實(shí)驗(yàn)（七）,前言,血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，除作為血液緩沖物質(zhì)而發(fā)揮作用外，其功能是在肺部結(jié)合氧氣，送到全身各組織并將組織中的二氧化碳送到肺部而呼出體外。,血紅蛋白分子是一種由亞鐵血紅素和珠蛋白結(jié)合而成的結(jié)合蛋白，由四個(gè)亞基構(gòu)成，分別為兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基。血紅蛋白的貯氧、運(yùn)氧功能都是依靠血紅素中的Fe2+與O2的配位結(jié)合，血紅蛋白與氧結(jié)合是以協(xié)同效應(yīng)方式進(jìn)行的。,除了運(yùn)載氧與二氧化碳，血紅蛋白還可以一氧化

2、碳、氰離子結(jié)合，結(jié)合的方式也與氧完全一樣，所不同的只是結(jié)合的牢固程度，一氧化碳、氰離子一旦和血紅蛋白結(jié)合就很難離開，這就是煤氣中毒和氰化物中毒的原理。,血紅蛋白的含量與年齡、性別、營養(yǎng)狀況和生活環(huán)境等因素有關(guān)。 正常人與運(yùn)動(dòng)員Hb含量沒有明顯差異。 初生兒 170一220g/L 嬰兒 160一200g/L 成

3、年女性 110一150g/L 成年男性 120一160g/L Hb的含量對(duì)運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力影響很大，對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)員的專項(xiàng)素質(zhì)尤為重要，因此，定期測定Hb的含量有助于了解運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)、對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)及身體機(jī)能水平等情況。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握722分光光度計(jì)的原理及操作方法； 2.了解比色法測定的原理；3. 掌握氰化高鐵血紅蛋白法的原理；4. 熟悉移液管的使用及末梢采血的方法；

4、5. 掌握血紅蛋白指標(biāo)測定的意義及在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的應(yīng)用。,722分光光度計(jì)的原理,光是一種電磁波，白光是由不同波長（400～760nm）的電磁波按一定比例組成的混合光，通過棱鏡可分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種顏色相連續(xù)的可見光譜。在白光的照射下，物體所以呈現(xiàn)特定的顏色，是因?yàn)槲矬w對(duì)不同波長的光有選擇性地吸收所致。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同波長的光線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。,T=I/I0&#

5、160;                                 其中：T  透過率 

6、                                I0  入射光強(qiáng)度  

7、    I  透射光強(qiáng)度                           A   

8、60;  吸光度       K  吸收系數(shù)                          

9、60;   L      溶液的光徑長度      C  溶液的濃度,分光光度分析技術(shù)的原理,綠 黃 青

10、 橙 白 青藍(lán)

11、 紅 藍(lán) 紫 上圖對(duì)應(yīng)的兩邊互為互補(bǔ)光，如將互補(bǔ)的色光相混即產(chǎn)生白光。 1. 分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒定物質(zhì)及其含量的方法。

12、 2.光投射到物體上可被物體吸收或反射，如該物體是透明的則還有部分光可以透過。在白光照射下，物體所呈現(xiàn)特定的顏色，就是物體對(duì)不同波長的光有選擇性的吸收所致。而溶液對(duì)某些波長的光的吸收極少而對(duì)其他波長的光吸收較多,則溶液就呈現(xiàn)這種吸收較少且透過較多光的顏色(如：硫酸銅溶液對(duì)黃光吸收最強(qiáng)，對(duì)藍(lán)光吸收最弱，故在白光的照射下該溶液呈現(xiàn)____) ，說明任何有色溶液(或物體)都只對(duì)一種單色光有強(qiáng)烈的吸收能力,而對(duì)其它波長的光吸收能力較弱。

13、,比色分析法的基本原理,比色分析法就是利用被測有色溶液吸收最強(qiáng)的單色光進(jìn)行比色測定的，這樣才能得到最滿意的結(jié)果。 當(dāng)一束單色光通過某溶液時(shí)，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及液層厚度L成正比，即溶液濃度越大，液層越厚，吸光越多 。朗伯—比爾定律：O.D=KLCO.D=溶液的吸光度A （光密度）L=光徑（光通過溶液的距離，既比色杯的厚度）C=樣品濃度（mol/L）K=摩爾吸光系數(shù)。它表示物質(zhì)的濃度為1mo

14、l/L，液層厚度為1cm時(shí)，溶液的吸光度。其單位為L/mol·cm 朗伯—比爾定律是比色分析方法的基本原理。,(一)人體血紅蛋白的測定實(shí)驗(yàn)原理,Hb被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白(Hi)，Hi與氰離子結(jié)合成氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)，它在540nm有一吸收峰，測其光密度而得Hb的濃度。 Hb+K3Fe(CN)б 氧化 Hi Hi+CN 合成 HiCN,實(shí)驗(yàn)試劑和

15、儀器,試劑： (1)HiCN稀釋液（有毒） （注：高鐵氰化鉀法測定血紅蛋白比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定，是目前國家承認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但試劑中有氰化物，劇毒，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中避免污染，實(shí)驗(yàn)完畢后注意藥品的處理，不能亂倒） (2)75%的酒精儀器： 722分光光度計(jì)、半自動(dòng)生化分析儀、一次性采血裝置、一次性采血管（20微升）、消毒棉球、5毫升試管、移液管,,測定管（一次性試管）氰化高鐵血紅蛋白稀釋液5ml酒精消毒手指，并采取新鮮血液2

16、0µl混勻后放置至少10分鐘540nm比色,空白調(diào)零讀取測定管光密度值,實(shí)驗(yàn)操作步驟,,,,,⑴采血部位必須無炎癥、水腫、充血及循環(huán)障礙。成人以無名指為宜。 ⑵被采血手指的手臂下垂1分鐘左右，輕輕按摩采血部位，使其自然充血，用75％酒精棉球消毒局部皮膚，待干。 ⑶緊控刺血部位，用采血針穿刺取血，動(dòng)作應(yīng)迅速，深度約2-3mm，輕微擠壓，以血液能流出為宜。 ⑷干棉球擦去第一滴血，毛細(xì)吸管精確吸血

17、20 µl (5)采血完畢，用干棉球壓住傷口，血止為止。 (6)拭凈毛細(xì)管外壁血跡，加入試管中，并將毛細(xì)吸血管重復(fù)吸洗，混勻,采血的過程,1 2 3 4 5 6 7 8,1 光源 2 聚光透鏡 3 色散棱鏡 4狹縫 5比色杯 6 光門

18、 7 光電管 8 檢流計(jì),722分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖,,,,,,,,,,,722分光光度計(jì)的使用（1）開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱20分鐘，選擇開關(guān)置于“T”檔（2）旋動(dòng)波長手輪，將測試所需540nm波長調(diào)節(jié)至刻度線處。（3）打開樣品室蓋，調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“0.00”。（4）以稀釋液（不含待測物質(zhì)的反應(yīng)液）作為空白，蓋上樣品室蓋，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”,然后將選

19、擇開關(guān)置于“A”檔，用稀釋液調(diào)消光零。（5）移入待測溶液，顯示值即為樣品的吸光度A值。,,,電源開關(guān),選擇開關(guān),722型分光光度計(jì),,,,波長手輪,0%T”旋鈕,100%T”旋鈕,比色杯（皿）,,樣品室,采血時(shí)，采血針應(yīng)一人一針，嚴(yán)防交叉感染。第一滴血棄去不用（為什么？）3. 毛細(xì)吸管吸血時(shí)，避免氣泡吸入。否則會(huì)使測定結(jié)果偏低。若有氣泡產(chǎn)生，請使用干棉簽吸之 。 4. 采血時(shí)，動(dòng)作應(yīng)迅速，否則易發(fā)生凝血現(xiàn)象。5. 配制好的H

20、iCN稀釋液中因氰化鉀含量低，毒性不是很大，但仍應(yīng)妥善保管。測定后的廢液不能與酸性溶液混合，因?yàn)榍杌浻鏊峥僧a(chǎn)生劇毒的氰氫酸氣體。為防止氰化鉀污染環(huán)境，比色測定后的廢液集中于廣口瓶中，可用除毒液除毒。,[注意事項(xiàng)],血紅蛋白（mol/L）= 測定管光密度/（摩爾吸光系數(shù)×液層光程)血紅蛋白（g/L）= （測定管光密度× 血紅蛋白分子量）/（摩爾吸光系數(shù)×液層光程) ×稀釋倍數(shù)

21、 =測定管光密度×（64456/44000）×251 = 測定管光密度 × 367.7式中： （1）64456是目前國際公認(rèn)的血紅蛋白分子量。 （2）44000 是國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)公布的血紅蛋白摩爾吸光系數(shù)。 （3）251是血樣稀釋倍數(shù)。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算,Hb在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的應(yīng)用： Hb指標(biāo)主要用于評(píng)定某個(gè)訓(xùn)練周期或階段，如根據(jù)1-2周時(shí)間

22、內(nèi)運(yùn)動(dòng)員對(duì)運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的反應(yīng)來評(píng)定運(yùn)動(dòng)員的機(jī)能狀態(tài)等。 Hb在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中的變化是多因素綜合作用的結(jié)果，如僅從運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的影響看，大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練期間系統(tǒng)測試血紅蛋白，可能會(huì)出現(xiàn)以下三種類型：（1）訓(xùn)練初Hb下降，經(jīng)一段訓(xùn)練后，Hb又逐步回升。（2）訓(xùn)練初Hb下降，經(jīng)一段訓(xùn)練后，始終未出現(xiàn)回升。（3）訓(xùn)練期間， Hb無顯著變化。 （1）表示運(yùn)動(dòng)量安排適宜；（2）、（3）則分別由于運(yùn)動(dòng)量過大，過小而未能出現(xiàn)血紅蛋白

23、的正常變化趨勢。因此，測試Hb的含量，對(duì)于評(píng)定運(yùn)動(dòng)員的機(jī)能狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練水平等具有重要的意義。,（二）ABO血型的鑒定血型的概念：是指血細(xì)胞上特異凝集原的類型。 ABO血型的分類依據(jù),備注：紅細(xì)胞表面上含凝集原，血清中含凝集素,（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑恚?通過用標(biāo)準(zhǔn)血型抗體對(duì)紅細(xì)胞膜上ABO系統(tǒng)血型抗原的鑒定，掌握ABO系統(tǒng)定型的基本操作方法，判讀技能。 根據(jù)lgM類特異性血型抗體與紅細(xì)胞上特異性抗原結(jié)合

24、能夠出現(xiàn)凝集反應(yīng)的原理。即：凝集原與其相對(duì)應(yīng)的凝集素相遇時(shí)將會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng) 例如： 凝集原A+抗A 凝集反應(yīng),,ABO血型的測定,抗B血清,,,,,,,,,,,,,,A 型,B 型,AB 型,O 型,抗A血清,（二）實(shí)驗(yàn)器材： 采血器具、玻片、玻棒、抗A抗B血型定型試劑（三）實(shí)驗(yàn)步驟：（玻片法）1.在白紙上分別注明“抗A”“抗B”字樣，并放上玻片，分別滴1~2滴血型定型劑；