血紅蛋白的提取和分離適合公開(kāi)課

1、請(qǐng)核對(duì)導(dǎo)學(xué)案答案,緒1.差異性2.來(lái)源和性質(zhì)3. 20 、 、4、2個(gè)α 、2個(gè)、亞鐵、一分子 氧、 一分子二氧化碳4.血紅蛋白含量豐富，容易獲取。,課前準(zhǔn)備 提前5分鐘,（一）樣品處理及粗提取1.樣品處理 、粗分離、純化 和純度鑒定。2.血漿、、雜蛋白、、檸檬酸鈉、、五、生理鹽 水、緩慢、低速短時(shí)、上清液沒(méi)有黃色3.紅細(xì)胞、等、蒸餾水、甲苯、磁力攪拌器4.血紅蛋白、高速離心

2、、無(wú) 、甲苯、白、脂溶 性沉淀、紅 、血紅蛋白溶液、暗紅、破碎物沉 淀、濾紙、脂溶性沉淀、分液漏斗、血紅蛋白 溶液5.無(wú)機(jī)鹽離子、有機(jī)小分子、透析袋、磷酸緩沖 液,（二）凝膠色譜操作2.交聯(lián)程度、膨脹程度和分離范圍、得水值、 7.5、蒸餾水、均勻 、氣泡、磷酸緩沖液 、 緊密 。3.管壁、凝膠面、色譜柱底部、5（三）操作提示1.白細(xì)胞2.洗脫液、沸水浴、微生物、空氣3.擾亂洗脫

3、液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,請(qǐng)拿出課本、雙色筆、導(dǎo)學(xué)案 讓我們準(zhǔn)備好進(jìn)行思維的碰撞,回顧：1.凝膠色譜法和電泳的基本原理？2.緩沖溶液的作用？,請(qǐng)3組A1闡述,請(qǐng)5組A2闡述,,知識(shí)回顧,凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理（根據(jù)分子量的大小） 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢； 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較短移動(dòng)速度較快； 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。凝膠電泳

4、的原理 帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生定向遷移，在加入SDS排除電荷多少的影響后，使電泳遷移率完全取決于分子大小，從而達(dá)到分離的目的。,課題3 血紅蛋白的提取和分離 ——實(shí)驗(yàn)操作要領(lǐng),知識(shí)目標(biāo)：（1）描述凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的步驟；（2）理解進(jìn)行樣品的預(yù)處理的目的；（3）運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分離純化。 重、難點(diǎn)：（1）描述凝膠色譜分離蛋白質(zhì)步驟；（2）運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分離

5、純化。,全班同學(xué)一起朗讀,蛋白質(zhì)提取和分離步驟,具體操作,步驟,（一）,（二）,（三）,（四）,哺乳血液,,血 漿,,水 分,固體物質(zhì),,血漿蛋白,無(wú)機(jī)鹽磷 脂葡萄糖等,血細(xì)胞,,白細(xì)胞,血小板,紅細(xì)胞（最多）,,血紅蛋白 （ ）,90％,有沒(méi)有，多不多，易不易,1.洗滌紅細(xì)胞,1.1 洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白1.2 洗滌過(guò)程：,血液100mL,重復(fù)洗滌3次，直至

6、上清液沒(méi)有,（一）樣品處理,黃色,2. 血紅蛋白的釋放,原理：紅細(xì)胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白,3.分離血紅蛋白溶液,分離過(guò)程：,紅細(xì)胞混合液,離心管,透析的目的是什么？,去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì),（二）粗分離——透析血紅蛋白,★注意事項(xiàng)★,（1）生理鹽水作用？,（3）兩次離心的差異？,（4）透析袋的作用機(jī)理？,模擬紅細(xì)胞生存環(huán)境，保持紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。,破碎紅細(xì)胞；溶解細(xì)胞膜釋放血紅蛋白。,前慢后快，前短后長(zhǎng)。,滲透作用,（2

7、）蒸餾水和甲苯的作用？,（三）純化,1.凝膠色譜柱的制作,（2）規(guī)格：玻璃管——長(zhǎng)40cm，內(nèi)徑1.6cm，兩端磨平； 橡皮塞——能塞入玻璃管，上平小凹； 移液管——0.5mL，長(zhǎng)5cm； 尼龍網(wǎng)——100目； 打孔器——移液管能塞入。,（1）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龍網(wǎng)

8、 尼龍管、打孔器、小刀、螺旋夾,2.凝膠色譜柱的填裝,（1）認(rèn)識(shí)凝膠Sephadex G－75 G :交聯(lián)程度、膨脹程度、分離范圍 75：凝膠得水值，即每克凝膠膨脹得水7.5克,（3）填裝：緩慢一次填裝，均勻，緊密、不能有氣泡，迅速 連接緩沖液,（2）認(rèn)識(shí)緩沖液：300mL、20mmol/L、PH=7.0磷酸緩沖液,3.樣品的加入和洗脫

9、,開(kāi)下端————,關(guān)下端——,開(kāi)下端—————,加樣,樣品完全滲入,緩沖液面=凝膠面,關(guān)下端————,加緩沖液接洗脫瓶,開(kāi)下端,注意：待紅色的蛋白質(zhì)接近柱底是，開(kāi)始收集， 連續(xù)收集，每管5ml,疑問(wèn)：連續(xù)收集得到的每一管中是否為同一分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)？,（四）純度鑒定—電泳,1.原理：帶電粒子在電場(chǎng)中發(fā)生定向遷移，從而把不同質(zhì)量和電量的粒子分離開(kāi)。加入電量遠(yuǎn)大于比粒子自身帶電量的SDS，排除電荷對(duì)粒子遷移大小

10、的影響，據(jù)此將不同分子質(zhì)量的粒子分開(kāi)。,2.電泳結(jié)果分析如果出現(xiàn)一個(gè)條帶：樣品中含有一個(gè)分子質(zhì)量級(jí)別多肽； 如果出現(xiàn)兩個(gè)條帶：樣品中含有兩個(gè)分子質(zhì)量級(jí)別多肽。,合作探究 6分鐘,題目：（1）探究問(wèn)題1、2、3（2）自己存在的其他疑問(wèn)要求：（1）小組長(zhǎng)搞好組織調(diào)控：先一對(duì)一討論，再組內(nèi)跨層 交流；重點(diǎn)討論答案的科學(xué)性；（2）討論形成的答案

11、要條理清晰、要點(diǎn)化、序號(hào)化。幫 助展示同學(xué)做好展示準(zhǔn)備。 A層 解決全部疑難，并幫助B層完善答案, 幫助其他同學(xué)解決疑難點(diǎn)。 B層 解決疑難后，負(fù)責(zé)展示。 C層 解決疑難，狂記導(dǎo)學(xué)案自主學(xué)習(xí)部分。,展示點(diǎn)評(píng)安排,題目,展示小組,點(diǎn)評(píng)小組,非展示同學(xué),探究1,討論完后B、C層落實(shí)基本原理的理解和記憶（3分鐘記?。〢層及時(shí)補(bǔ)充點(diǎn)評(píng),探究2,探究3,,,,,,,,,,,,,,,

12、,,,,點(diǎn)評(píng)、拓展、升華 約10分鐘①點(diǎn)評(píng)答題規(guī)范、答案的正誤或全面否，進(jìn)行答案的補(bǔ)充修正，或知識(shí)拓展，或規(guī)律方法的總結(jié)。②其他同學(xué)注意傾聽(tīng)、積極思考,重點(diǎn)內(nèi)容記好筆記。有不明白或有補(bǔ)充的同學(xué)要大膽提出。③其它小組可進(jìn)行補(bǔ)充點(diǎn)評(píng)或拓展,我的舞臺(tái)我做主 20分鐘,1B2,4B2、5B1,2B1、3B1,6B1,7B2,8B2,要求：①展示人及時(shí)到位，規(guī)范快速、脫稿。②答案要序號(hào)化、要點(diǎn)化。③組長(zhǎng)搞好調(diào)控，可分工展示。④準(zhǔn)

13、備質(zhì)疑、補(bǔ)充，高效科研小組成員發(fā)揮帶頭作用。,鞏固反芻,要求：1.B層、C層結(jié)合學(xué)習(xí)目標(biāo)，鞏固落實(shí)本課的基礎(chǔ)知 識(shí)；A層達(dá)成目標(biāo)后，整理合作探究答案。2.組長(zhǎng)抽查本組基礎(chǔ)知識(shí)的掌握情況。,（1）記憶凝膠色譜分離蛋白質(zhì)的步驟；（2）理解進(jìn)行樣品的預(yù)處理的目的；,本堂小結(jié),本節(jié)內(nèi)容目標(biāo)：獲取血紅蛋白溶液,獲 取紅細(xì)胞（離心）,破碎紅細(xì)胞，釋放血紅蛋白,從各紅細(xì)胞的成分中獲取血紅蛋白 （離心）,初步純化血紅蛋白（透

14、析）,,,,1.下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述正確的是（ ）多選 A.樣品的處理就是通過(guò)一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B.通過(guò)透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C.可通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化 D.可通過(guò)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度,ACD,2.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（ ） A.可采

15、集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料 B.用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞 C.血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心 D.洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開(kāi)始收集流出液,A,2組A1,1組A2,當(dāng)堂反饋,3.樣品的加入和洗脫的操作不正確的是?。?）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A.加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩 沖液緩慢下降到凝膠面的下面B.加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C.等

16、樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D.用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要 破壞凝膠面,4.在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的原因是（ ）A.氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B.氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)C.氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D.氣泡在裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不緊密,A,A,5組A2,3組A1,6.下列操作正確的是（ ）A.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心 B.紅細(xì)胞釋放

17、出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心 D.透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12h,5.選用紅細(xì)胞作分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，下列是其優(yōu)點(diǎn)的是 ( )多A.血紅蛋白是有色蛋白 　　 B.紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核C.紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高 　　D.紅細(xì)胞DNA含量高,ABC,D,4組A1,6組A2,7.下面關(guān)于對(duì)血紅蛋白提取和分離的樣品的處理措施中，正確的是 (

18、 )多A.采集血樣后要高速短時(shí)問(wèn)離心獲得血細(xì)胞B.洗滌三次后如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則血 漿蛋白無(wú)法除凈。C.在蒸餾水和甲苯的作用下，細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白D.釋放血紅蛋白后再經(jīng)過(guò)離心，就可以使血紅蛋白和其他雜 質(zhì)分離開(kāi)來(lái),BCD,8組A2,8.在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品處理過(guò)程中，分析無(wú)誤的是 ( )A洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽B洗滌時(shí)離心速度過(guò)小，